芪白平肺胶囊对慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺证大鼠血清CAM－2和VEGF的影响

王婕琼，尹婷婷，李泽庚

（1．湖北中医药大学，湖北 武汉 430065，2．安徽中医药大学，安徽 合肥 230012）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）主要累及肺脏，但也可引起全身或肺外的不良效应，是临床常见病、多发病，严重危害人类健康［1］。COPD患者伴发肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）占80%左右，PAH是COPD发展到肺源性心脏病的中心环节，易导致右心衰竭和死亡，严重影响COPD患者的病程、生活质量和预后。肺血管收缩是肺血管阻力增加引起肺动脉高压的主要机制，其形成过程较为复杂，正确认识COPD的病程，抑制肺血管收缩，防止PAH等并发症的产生对防治COPD具有重要现实意义［2］。有研究［3－5］表明，肺血管活性物质的调节机制在肺血管重建和缺氧性肺动脉收缩发病过程中作用重大，在COPD产生PAH 过程中产生重要作用。本研究通过应用临床防治COPD并发PAH的有效方药，观察其对模型大鼠血清钙调节蛋白－2（calmodulin－2，CAM－2）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的影响。

1 材料

1．1 实验动物 选用清洁级健康Wistar雄性大鼠280只，雄性，6月龄，体质量为（230±20）g，实验动物由安徽医科大学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（皖）2012－0006。

1．2 药物 芪白平肺胶囊：由黄芪、生晒参、川芎、薤白、葶苈子、五味子、地龙组成，每片0．4g，由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供，生产批号为BZ20080023；尼可地尔：每片5mg，中外制药株式会社生产，生产批号为H20060401；0．9%生理盐水。

1．3 主要试剂及仪器 动物强迫游泳装置、熏烟箱：安徽中医药大学第一附属医院研制；动物实验低氧装置：长沙华曦电子科技有限公司；红梅牌香烟：焦油含量13mg，烟碱含量1．0mg，红塔卷烟集团生产；洗板机：普朗DNX－9620型；37℃温箱；酶标仪：型号 WD－2102A；大鼠 CAM－2、VEGF ELISA检测试剂盒：美国Sigma公司。

2 方法

2．1 模型复制方法 参照李泽庚等［6］的方法，每日将大鼠放入（43±1）℃的恒温水槽中强迫游泳30 min，后置于熏烟箱内烟熏1h，最后将大鼠置于常压低氧装置内7h，氧浓度控制在（10±0．5）%。每周6次，第7天暂停，连续4周。

2．2 动物分组和处理方法 随机将280只大鼠分为模型组60只、正常组60只、芪白平肺胶囊预防组（芪预组）40只、芪白平肺胶囊治疗组（芪治组）40只、尼可地尔预防组（尼预组）40只，尼可地尔治疗组（尼治组）40只。从实验第一天开始，对除正常组之外的各组大鼠按上述方法复制模型，每日模型复制结束后灌胃。模型组、正常组每日用生理盐水10 mL／kg灌胃，于实验第4周末、第8周末、第12周末各取材20只。预防组在复制模型同时进行药物干预，灌胃4周后取材20只大鼠，剩下20只大鼠停止灌胃再正常喂养4周后（即实验第8周末）取材。模型复制成功后对治疗组进行药物干预，灌胃4周后（即实验第8周末）取材20只大鼠，剩下20只停止灌胃再正常喂养4周后（即实验第12周末）取材。灌胃药物剂量：芪白平肺胶囊药液10mL／kg（每毫升含芪白平肺胶囊内容物50mg，相当于临床剂量7倍），尼可地尔10mL／kg（每毫升含尼可地尔0．3mg，相当于临床剂量7倍）。取内容物药粉用生理盐水配成所需浓度的混悬液，给药容量均为10mL／kg。

2．3 血清CAM－2和VEGF的测定 大鼠经腹腔注射3．4%水合氯醛（10mL／kg）麻醉后，于腹主动脉采血2～3mL，低温离心（3 000r／min，4℃）20 min，取上清液保存于－80℃冰箱待用，用酶联免疫吸附法测定。

2．4 统计学方法 应用SPSS 17．0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（±s）进行统计学描述。由于这是多因素非平衡设计的组合实验，因此按照研究目的拆分成3个组合分别进行统计学分析。①对照组和模型组：采用两因素方差分析考察时间和模型因素对相关指标的影响；②模型组、芪预组、尼预组：采用两因素方差分析考察时间和预防性给药对相关指标的影响；③模型组、芪治组、尼治组：采用两因素方差分析考察时间和治疗性给药对相关指标的影响。简单效应分析采用LSD检验进行均数的多重比较。P＜0．05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3．1 模型和时间因素对大鼠血清CAM－2、VEGF含量的影响 两因素方差分析结果（表1）显示，模型因素和时间因素对大鼠血清CAM－2和VEGF水平的主效应及其交互作用均具有统计学意义（P＜0．05）。简单效应分析结果（表2）显示，实验第12周时，正常组CAM－2水平显著高于第8周时和第4周时，而各时间VEGF水平比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；模型组在实验第8周和第12周时，血清CAM－2和VEGF水平均较前一时点显著变化（P＜0．05）；各时点模型组血清CAM－2水平均较对照组显著降低（P＜0．05），VEGF水平均较对照组显著升高（P＜0．05）。可以推断，模型因素可以降低大鼠血清CAM－2水平，升高血清VEGF水平，模型因素对血清CAM－2和VEGF的影响与时间有关。

表1 模型和时间因素对大鼠血清CAM－2、VEGF影响的两因素方差分析结果

3．2 药物预防和时间因素对模型大鼠血清CAM－2、VEGF含量的影响 两因素方差分析结果（表3）显示，药物预防和时间因素对模型大鼠血清CAM－2和VEGF的主效应及其交互作用均具有统计学意义（P＜0．05）。简单效应分析结果（表4）显示，与同时间模型组比较，尼预组和芪预组大鼠血清CAM－2水平显著升高（P＜0．05），而血清VEGF水平显著降低（P＜0．05）。与同时间尼预组比较，芪预组CAM－2水平显著升高（P＜0．05），VEGF水平显著降低（P＜0．05）。可以推断，尼可地尔和芪白平肺胶囊预防给药可升高模型大鼠血清CAM－2水平，降低血清VEGF水平，且以芪白平肺胶囊的作用为优，芪白平肺胶囊的远期效应较明显。

表2 模型和时间因素对大鼠血清CAM－2、VEGF的影响（±s）

表2 模型和时间因素对大鼠血清CAM－2、VEGF的影响（±s）

注：与同时间正常组比较，＊P＜0．05；与同组4周末比较，＃P＜0．05；与同组8周末比较，△P＜0．05。

4周末 正常2 0 3 1．0 8±2．6 6 4 0．1 4±1．5 2模型 2 0 1 7．3 5±0．6 9＊ 1 7 1．9 4±3．4 2＊8周末 正常 2 0 3 0．9 2±1．9 3＃ 3 8．8 5±1．5 0模型 2 0 1 8．6 6±0．7 3＊＃ 1 7 7．8 2±2．7 1＊＃1 2周末 正常 2 0 2 9．5 1±1．8 8＃△ 3 9．1 1±1．6 1模型 2 0 1 2．1 4±0．6 6＊＃△ 1 8 1．4 0±2．2 0＊＃△

3．3 药物治疗和时间因素对模型大鼠血清CAM－2、VEGF水平的影响 两因素方差分析结果（表5）显示，药物治疗和时间因素对模型大鼠血清CAM－2和VEGF的主效应及其交互作用均具有统计学意义（P＜0．05）。简单效应的方差分析结果（表6）显示，与同一时点模型组比较，芪治组和尼治组大鼠血清 CAM－2水平显著升高（P＜0．05），VEGF水平显著降低（P＜0．05）；在实验第12周，芪治组大鼠血清VEGF水平显著低于尼治组（P＜0．05）。与实验第8周时比较，模型组第12周时CAM－2水平显著降低（P＜0．05），模型组和尼治组第12周时VEGF水平显著升高（P＜0．05），而芪治组第12周时CAM－2和VEGF水平均无明显变化（P＞0．05）。可以推断，芪白平肺胶囊和尼可地尔治疗性给药均可升高模型大鼠血清CAM－2水平，降低血清VEGF水平，芪白平肺胶囊降低血清VEGF的远期效应优于尼可地尔。

表3 药物预防和时间因素对模型大鼠血清CAM－2、VEGF影响的两因素方差分析结果

表4 药物预防和时间因素对模型大鼠血清CAM－2、VEGF的影响（±s）

表4 药物预防和时间因素对模型大鼠血清CAM－2、VEGF的影响（±s）

注：与同时间模型组比较，＊P＜0．05；与同时间尼预组比较，＃P＜0．05；与同组4周末比较，△P＜0．05。

时间 分组 n C A M－2／（p g／m L） V E G F／（p g／m L）4周末 模型2 0 1 7．3 5±0．6 9 1 7 1．9 4±3．4 2尼预 2 0 2 0．8 5±1．1 1＊ 5 0．3 3±3．0 9＊芪预 2 0 2 6．8 3±1．2 5＊＃ 5 1．0 5±2．3 9＊8周末 模型 2 0 1 8．6 6±0．7 3△ 1 7 7．8 2±2．7 1△尼预 2 0 2 3．3 9±2．3 0＊△ 7 0．5 2±2．3 4＊△芪预 2 0 2 8．2 8±2．2 8＊＃△ 5 0．9 9±2．6 7＊＃

4 讨论

《素问·灵兰秘典论》记载：“肺者，相傅之官，治节出焉。”意指肺气具有治理调节呼吸及全身气血津液运行的作用。COPD反复发作、长期不愈，伤肺耗气，阳气微弱而失助心行血之职，致使肺气虚而失治节，水液不循常道而凝聚为痰，血液运行无力而停滞为瘀，终成痰瘀阻肺之证。因此，COPD的治节失常的典型证候为痰瘀阻肺证，符合COPD并发PAH阶段的临床证候表现。益气化痰祛瘀方“芪白平肺胶囊”，以“治节重建”为理念，由黄芪、生晒参、川芎、薤白、葶苈子、五味子、地龙组成。方中黄芪、生晒参补益脾肺之元气，合为君药，共奏益气之功；“血中气药”川芎具有行气活血之效，薤白理气通阳，葶苈子行水消肿，泻肺平喘，三者共为臣药。五味子酸甘敛阴，能上敛肺气，下滋肾阴，为治疗久咳虚喘之要药。地龙通行经络，清肺定喘，功在佐使。诸药合用，共奏益气、温阳、化痰、散瘀之功［7］。

结合既往研究成果，笔者认为COPD痰瘀阻肺证相当于COPD致PAH阶段。肺血管内皮细胞通过多种途径分泌各种血管活性物质调节自身生长，这在肺血管收缩导致PAH的发病机制中作用十分重要。研究［8］表明，当血管活性物质一旦被激活，气道、肺实质和肺血管释放大量炎性递质，肺小动脉内皮细胞受到损害，发生功能紊乱，调节相关细胞因子的表达，导致血管内皮细胞和平滑肌细胞异常增生肥大，引起管壁增生、管腔狭窄、平滑肌增殖、管壁胶原纤维沉积，导致肺血管收缩，最终形成低氧性PAH。因此，有必要深入研究肺血管活性物质在PAH产生过程中的作用机制。

表5 药物治疗和时间因素对模型大鼠血清CAM－2、VEGF影响的两因素方差分析结果

表6 药物治疗和时间因素对模型大鼠血清CAM－2、VEGF的影响（±s）

表6 药物治疗和时间因素对模型大鼠血清CAM－2、VEGF的影响（±s）

注：与同时间模型组比较，＊P＜0．05；与同时间尼治组比较，＃P＜0．05；与同组8周末比较，△P＜0．05。

时间 分组 n C A M－2／（p g／m L） V E G F／（p g／m L）8周末 模型2 0 1 8．6 6±0．7 3 1 7 7．8 2±2．7 1尼治 2 0 2 0．2 3±2．7 0＊ 5 2．1 3±2．3 8＊芪治 2 0 2 0．3 5±1．9 2＊ 5 1．4 2±2．6 4＊1 2周末 模型 2 0 1 2．1 4±0．6 6△ 1 8 1．4 0±2．2 0△尼治 2 0 2 0．3 5±2．4 1＊ 7 1．7 2±2．7 7＊△芪治 2 0 1 9．5 0±1．5 2＊ 5 0．2 3±2．9 8＊＃

CAM－2是存在于肺血管平滑肌真核细胞中的一种调节蛋白，参与平滑肌细胞的兴奋－收缩偶联过程。在维持平滑肌细胞膜的稳定性方面有重要的作用。CAM－2能调节平滑肌的收缩和舒张。静息状态下CAM－2无活性，当细胞内Ca2＋浓度升高到一定程度，与其细胞内受体钙调素结合形成Ca2＋－CaM复合物才具有生物活性。后者通过一系列磷酸化过程引起肺血管平滑肌细胞收缩，使血管平滑肌对各种刺激的敏感性增高，收缩力加强。引起肺血管平滑肌的肥厚和细胞增殖［9］。

VEGF是可以促进肺部平滑肌内血管形成的一种多肽。其有两大生物学功能：一是增加肺血管通透性，是已知最强的肺血管通透剂，二是生成肺血管功能。研究［10］发现，VEGF越高，肺血管平滑肌收缩的速度越快，并且VEGF拮抗物的应用能直接抑制肺血管内皮细胞增殖和分化，促进内皮细胞凋亡，分泌多种组织蛋白酶，介导迁移和浸润，抑制肺血管收缩。

本研究表明，芪白平肺胶囊和尼可地尔均可调节COPD痰瘀阻肺证模型大鼠血清CAM－2和VEGF的异常，且芪白平肺胶囊预防性给药和治疗性给药的效果均优于尼可地尔，说明益气化痰祛瘀方药芪白平肺胶囊的近期疗效和远期效应更佳，作用效果更持久。临床上长期应用芪白平肺胶囊治疗COPD取得较好疗效［11－13］，可降低PAH，提高生活质量。其作用机制可能与调节肺血管活性物质，干预肺血管收缩有关，这尚需进一步深入探讨。

［1］中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组．慢性阻塞性肺疾病诊治指南：2013年修订版［J］．中华结核和呼吸杂志，2013，36（4）：1－10．

［2］荆志成．2010年中国肺高血压诊治指南［J］．中国医学前沿杂志：电子版，2011，3（2）：62－81．

［3］Galie N，Hoeper MM，Humbert M，et al．Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension［J］．Eur Heart J，2009，30（20）：2493－2537．

［4］高云，罗凤鸣，范志航．血管内皮生长因子与肺部疾病的关系［J］．中华哮喘杂志：电子版，2013，7（5）：53－55．

［5］王丽静，罗百灵，戴文鑫．血管内皮生长因子在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺血管重塑中的作用［J］．中华结核和呼吸杂志，2007，30（3）：228－229．

［6］李泽庚，王传博，彭波，等．慢性阻塞性肺疾病痰瘀阻肺证大鼠模型的建立［J］．天津中医药，2010，27（1）：43－45．

［7］国家中医药管理局慢性阻塞性肺疾病肺气虚证重点研究室．慢性阻塞性肺疾病肺气虚证候演变规律及其兼夹证专家共识［J］．中华中医药杂志，2014，29（4）：1179－1180．

［8］骆仙芳，沈华浩．慢性阻塞性肺疾病与肺血管系统［J］．国外医学：呼吸系统分册，2005，25（6）：433－435．

［9］Kim S，Nadel JA．Fibrinogen binding to CAM promotes EGFR－dependent mucin production in human airway epithelial cells［J］．Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297（1）：174－183．

［10］郝敏．低分子肝素对COPD模型大鼠肺组织低氧诱导因子－1、血红素加氧酶－1、血管内皮生长因子表达的影响［D］．青岛：青岛大学，2012．

［11］彭波，李泽庚，王传博，等．芪白平肺胶囊对COPD致肺动脉高压患者血液流变学的影响［J］．江苏中医药，2012，44（2）：19－20．

［12］李泽庚，王传博，彭波，等．芪白平肺胶囊对慢性阻塞性肺疾病患者BODE指数的影响［J］．中医杂志，2010，51（11）：987－989．

［13］王传博，李泽庚，彭波，等．芪白平肺胶囊对慢阻肺患者圣乔治呼吸问卷积分的影响［J］．中华中医药学刊，2012，30（2）：266－268．