咳喘停贴剂穴位贴敷对慢性哮喘大鼠肺组织抑炎细胞因子的影响

刘兰英，乔 明，周 媛，高 峰，王和生，滕凤猛

（1．江苏省中医院，江苏 南京 210029；2．连云港市中医院，江苏 连云港 222001；3．南京中医药大学第二临床医学院，江苏 南京 210029）

慢性气道炎症是支气管哮喘复发的主要病理机制之一，其中辅助性 T细胞1（T－helper 1，Th1）产生以干扰素－γ（interferon－γ，IFN－γ）、白细胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、IL－12等为代表的抑炎细胞因子，导致慢性气道炎症加重［1］。吸入含有糖皮质激素的复方制剂是目前主要治疗方法之一，能在一定程度上改善症状，但仍然不能有效缓解其复发的频率和程度。中医学认为该病属于“哮喘”“哮证”“喘鸣”“呷嗽”等范畴。王执中《针灸资生经》云：“因与人治哮喘，只缪肺俞，不缪他穴”，为背俞穴治疗哮喘开辟了先河。

笔者前期研究［2］发现，咳喘停贴剂可能通过降低慢性哮喘模型大鼠支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中促炎细胞因子IL－6、IL－13的含量来发挥抗炎作用，其作用与布地奈德、地塞米松相当。本研究拟通过复制慢性过敏性哮喘大鼠模型，观察咳喘停贴剂穴位贴敷对 Th1相关抑炎细胞因子IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影响，并与地塞米松、布地奈德的作用比较，从而探讨该贴剂改善慢性气道炎症的可能作用机制。

1 材料

1．1 动物 SPF级雄性Wistar大鼠48只，上海西普尔必凯实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（沪）2008－0016，6周龄，体质量（160±20）g，在室温18～22℃、湿度28%的环境中饲养1周后使用。

1．2 仪器 鱼跃402AI型超声雾化器：江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；非完全密闭玻璃箱（30cm×40 cm×50cm）：自制；Olympus BX－51型病理图像采集系统：日本奥林巴斯公司；240351型BioTek酶标仪：美国伯腾仪器有限公司。

1．3 试剂 卵蛋白（ovalbumin，OVA）：纯度≥98%，美国sigma公司；氢氧化铝（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；地塞米松磷酸钠注射液（容量1mL，含药5mg）：山西晋新双鹤药业；布地奈德混悬液（容积2mL，含药1mg）：阿斯利康制药有限公司；IFN－γ试剂盒（批号 KGERC101g）、IL－2试剂盒（批号 KGER028）、IL－12试剂盒（批号 KGER036）：均购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1．4 药物 咳喘停贴剂：由南京中医药大学附属医院制剂部制备。药物组成：白芥子、生甘遂、细辛、延胡索、麻黄、肉桂等9味中药，分别打粉过200目筛，按一定比例混合后加生姜汁、凡士林做成直径1cm，质量约为0．3g的丸剂，置于5cm×5cm胶布上的贴剂。假贴剂：面粉加同上比例的生姜汁、凡士林做成直径1cm，质量约为0．3g的丸剂，置于5cm×5cm胶布上的贴剂。地塞米松磷酸钠注射液：每支5mg。布地奈德雾化混悬液：每支1mg。

2 方法

2．1 实验分组 48只大鼠，称质量后被随机分成6组，分别为：正常组、模型组、穴位假贴敷组、布地奈德组、地塞米松组、穴位贴敷组。每组8只大鼠。

2．2 慢性哮喘大鼠模型复制 参考Palmans等的方法［3］制备OVA致敏慢性哮喘气道炎症大鼠模型。从第1天首次接受OVA注射，至第14天为致敏阶段。第15～56天为持续激发阶段（6周）。致敏阶段：第1天予大鼠（正常组除外）腹腔注射OVA和氢氧化铝混合溶液1mL（含OVA 10mg、氢氧化铝100mg）；第8天再次腹腔注射加强致敏。激发阶段：第15天开始，将大鼠置于自备密闭雾化箱内，予1%OVA溶液雾化吸入，每次30min，隔日1次。其间观察大鼠是否出现喷嚏，及其呼吸、口唇、腹部及活动度的异常反应，直到第56天雾化结束。

2．3 分组治疗 从第57天起，对正常组和模型组以外的大鼠进行治疗。布地奈德组：布地奈德166．67mg／m3雾化吸入30min，共治疗14d。地塞米松组：每只大鼠腹腔注射地塞米松1mg／kg，每日1次。穴位假贴敷组：假贴剂贴敷于双侧肺俞、脾俞、肾俞穴（取穴方法参考李忠仁主编的《实验针灸学》［4］），在穴区脱毛后将药丸压成直径约1cm圆饼状，用胶布固定到穴位上，6h后去除，每日1次，共治疗14d［5］。穴位贴敷组：咳喘停贴剂贴敷于上述穴位，方法同上。正常组：正常喂养不做其他处理。模型组：模型复制后正常喂养，不做其他处理。

2．4 观察指标及方法

2．4．1 慢性哮喘模型大鼠行为学评价 观察慢性哮喘模型大鼠活动度、毛发情况；雾化激发时是否出现典型哮喘样发作：如呼吸急促，张口喘息，喷嚏，口唇发绀，前肢缩抬，点头呼吸，腹部翕动及行动迟缓等。

2．4．2 肺组织形态学观察 大鼠用10%水合氯醛（3．5mL／kg）腹腔注射麻醉后，无菌操作皮肤，打开胸腔，夹闭其右主支气管，从气管缓缓注入生理盐水4mL灌洗左肺，反复3次，收集BALF，离心（2 000～3 000r／min），取其上清液并进行分装检测。取右肺中叶，在4℃生理盐水中漂洗干净，立即投入10%甲醛溶液中固定24h，石蜡包埋，切片，苏木精－伊红（hematoxylin－eosin，HE）染色，观察肺组织形态学变化。

2．4．3 BALF中促炎细胞因子含量 ELISA法测定大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量，按试剂盒说明书进行操作。

2．5 统计学方法 采用SPSS 20．0统计软件进行统计分析。连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。由于这是单因素非均衡设计的组合实验，按研究目的拆分成2个组合。①正常组和模型组：均数比较采用两个独立样本t检验。②模型组、穴位假贴敷组、布地奈德组、地塞米松组、穴位贴敷组：多组间均数比较，采用单因素方差分析；组间均数多重比较，采用LSD检验（方差齐时）或Dunnett'sT3检验（方差不齐时）。P＜0．05表示差异有统计学意义。

3 结果

3．1 慢性哮喘模型大鼠行为学评价 正常组大鼠活动正常，无喘促等表现。模型组大鼠表现为毛发暗淡、竖毛、倦怠。雾化激发时部分大鼠出现典型哮喘样发作，如呼吸急促，喘息，点头呼吸，腹部翕动，行动减少，并随着激发次数增加症状逐步加重。部分大鼠出现阵发性喷嚏，随着激发次数增加喷嚏次数增加。

3．2 肺组织形态学观察 正常组大鼠肺泡形态规则，肺间质有少量炎性细胞浸润。模型组大鼠肺泡腔缩小，其内见炎性细胞浸润及黏液栓，肺间质增厚，可见大量炎性细胞浸润。穴位假贴敷组与模型组大鼠相似，肺泡腔缩小，其内见炎性细胞浸润及黏液栓，肺间质增厚，可见大量炎性细胞浸润。布地奈德组与模型组大鼠比较，支气管腔内黏液栓减少，肺间质增厚，可见炎性细胞浸润。地塞米松组与模型组大鼠比较，可见肺大泡、肺泡内黏液栓明显减少，肺间质略增厚。穴位贴敷组与模型组大鼠比较，可见部分肺大泡、肺泡腔内少量黏液栓，肺间质略增厚，其内有少量炎性细胞浸润。见图1。

3．3 模型因素对大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影响 与正常组比较，模型组大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量均显著降低（P＜0．05）。说明模型因素对大鼠 BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量具有明显影响。见表1。

3．4 药物干预对慢性哮喘模型大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影响 穴位假贴敷组与模型组BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量比较，差异无统计学意义（P＞0．05）；与模型组比较，布地奈德组、地塞米松组、穴位贴敷组大鼠BALF中IFN－γ、IL－12含量均显著升高（P＜0．05），IL－2含量呈升高趋势（P＞0．05）。布地奈德组、地塞米松组、穴位贴敷组3组之间IFN－γ、IL－2、IL－12含量比较，差异均无统计学意义（P＞0．05）。见表2。

表1 模型因素对大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影响（±s）

表1 模型因素对大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影响（±s）

注：与对照组比较，＃P＜0．05。

组别 n I F N－γ／（p g／m L）I L－2／（p g／m L）I L－1 2／（p g／m L）正常8 6 2．6 1±6．6 3 5 8．2 2±1 0．3 1 1 4．8 6±4．2 2模型 8 4 4．6 6±8．4 0＃ 3 2．9 4± 7．2 4＃ 5．8 6±1．9 4＃

表2 药物干预对慢性哮喘大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影响（±s）

表2 药物干预对慢性哮喘大鼠BALF中IFN－γ、IL－2、IL－12含量的影响（±s）

注：同列具有相同右上标符号的组别相比较，P＞0．05；同列不含相同右上标符号的组别相比较，P＜0．05。

组 别 n IFN－γ／（pg／mL）IL－2／（pg／mL）IL－12／（pg／mL）模 型 8 44．66±8．40＃ 32．94± 7．24＃ 5．86±1．94＃穴位假贴敷 8 40．08±4．98＃ 33．08± 6．08＃ 5．35±1．78＃布地奈德 8 53．01±6．28△ 45．27±10．08＃ 9．73±2．01△地塞米松 8 54．11±7．11△ 46．31±13．32＃ 9．25±2．76△穴位贴敷 8 52．13±9．46△ 46．55±16．78＃ 8．54±1．73△

4 讨论

前期研究［6－7］发现，咳喘停贴剂穴位贴敷治疗慢性哮喘，可通过增加Th1相关T－bet mRNA的表达，降低Th2相关GATA－3mRNA的表达来调节Th1／Th2的失衡，从而起到改善慢性气道炎症的作用，其作用与地塞米松相似。IFN－γ可抑制IL－4诱导IgE的合成，参加哮喘的速发性和迟发性变态反应。冯梅晶等［8］发现，支气管哮喘急性发作患儿吸入IFN－γ联合口服孟鲁司特钠，可快速缓解症状，减轻气道炎症。谢海棠等［9］发现哮喘患儿IFN－γ水平及第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1）明显低于健康儿童，IFN－γ水平与FEV1成正相关。薛涛［10］研究发现，哮喘患儿血清中IL－2显著低于健康儿童，予支气管扩张剂及糖皮质激素治疗后IL－2明显升高。

本研究采用的咳喘停贴剂为江苏省中医院针灸康复科治疗支气管哮喘的经验方［11］，由《张氏医通》中白芥子贴结合小青龙汤加减而成。在前期研究［12］中发现，在三伏天对小儿哮喘缓解期用穴位贴敷治疗可有效改善其复发情况。白芥子贴首见于清代张璐《张氏医通·诸气门下·喘》：“冷哮……夏月三伏中，用白芥子涂法，往往获效。”该书中提出白芥子贴由四味中药组成：白芥子、生甘遂、细辛、延胡索。苟晓红［13］用白芥子散穴位贴敷背俞穴治疗支气管哮喘，治疗后1年内患者复发情况较治疗前明显改善。甘遂水煎剂可提高免疫复合物与巨噬细胞的结合能力，且表现出量效关系［14］。延胡索中所含的延胡索乙素等成分可解除支气管痉挛，促进渗出物吸收［15］。李亚男等［16］发现细辛、白芥子、甘遂等成分对延胡索乙素经皮渗透有显著促进作用。小青龙汤具有解表化饮、止咳平喘之功［17］。本方中麻黄乃“喘家圣药”，性温，味辛，归肺经，为君药，可宣肺平喘；桂枝性温，味辛甘，归肺经，为臣药，可调和营卫；细辛性温，味辛，归肺经，为佐药。研究证实，小青龙汤能够改善气道炎症，调节IL－4和IFN－γ的比例失衡［18］。麻黄的水提物及其醇提物有降低血清溶血素、抗变态反应及抗补体作用，其有效成分麻黄碱，具有舒张支气管平滑肌、解除支气管痉挛的作用［19］。细辛含挥发油甲基丁香酚，具有抗炎、抗组胺、抑制IL－2受体表达，对豚鼠气管有明显的松弛作用，可缓解豚鼠哮喘发作时气道的痉挛［20］。

中医学认为，慢性哮喘多为“冷哮”，宿痰内伏于肺，复加各种原因，引动肺内伏痰，肺气上逆而致哮喘。患者可见反复发作的咳喘、痰鸣、气短、疲乏、自汗、脉虚无力等，其主要病位在肺，连及脾肾两脏。因此，其治疗应补益肺、脾、肾三脏阳气以治其本，宣肺化痰平喘以治其标。刘立公等［21］通过检索古医籍中膀胱经腧穴的主治功能，发现膀胱经经穴具有宣肺散寒、壮肾利尿之功。刘梦琳［22］通过临床观察发现，艾灸背部膀胱经穴位对喘证具有好的疗效。

本研究显示，穴位贴敷可使慢性哮喘大鼠BALF中IFN－γ、IL－12含量明显升高（P＜0．05），IL－2含量呈现升高趋势（P＞0．05），其作用明显优于穴位假贴敷疗法，且与布地奈德、地塞米松的作用相当。说明穴位贴敷可通过增加气道抑炎因子IFN－γ、IL－12含量来改善慢性气道炎症。

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