不同降解方式对硫酸软骨素寡糖抗氧化活性的影响

2015-12-18王俊曾凡新程薇熊光权乔宇吴文锦张金木鉏晓艳史德芳汪兰

湖北农业科学 2015年22期

王俊　曾凡新　程薇　熊光权　乔宇　吴文锦　张金木　鉏晓艳　史德芳　汪兰

摘要：以鲟鱼（Acipenser sinensis）硫酸软骨素为原料，分别采用盐酸酸解法、过氧化氢氧化法、草酸降解法和辐照降解法对其进行处理，使得鲟鱼硫酸软骨素的相对分子质量从35 193分别降至1 841、1 155、 2 089和3 049，相对分子质量明显减小，且对DPPH·和·OH的清除能力及Fe3+还原能力明显提高。结果显示，过氧化氢降解所得硫酸软骨素寡糖抗氧化性能很好，当浓度为500 μg/mL时，对DPPH·和·OH的清除率可达85%和70%。

关键词：鲟鱼（Acipenser sinensis）；硫酸软骨素；相对分子质量；抗氧化活性

中图分类号：S98；TS254 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）22-5707-04

Abstract： Taking sturgeon chondroitin sulfate as raw materials and adopting HCl acid solution， hydrogen peroxide， oxalic acid and radiation to degrade it. The results showed that the relative molecular weight of chondroitin sulfate had respectively dropped from 35 193 to 1 841， 1 155， 2 089 and 3 049. Molecular weight was greatly reduced compared with that of the raw material. In addition， the scavenging activity on DPPH o and OH o and the reducing activity on Fe3+ has been greatly increased. The results showed that chondroitin sulfate with hydrogen peroxide degradation had good oxidation resistance， when the concentration of oligosaccharide is 0.5 mg/mL， the inhibition rate on DPPH· and OH· could reach 85% and 70%.

Key words： Acipenser sinensis； the oligosaccharide of chondroitin sulfate；relative molecular weight； oxidation resistance

硫酸軟骨素（Chondroitin sulfate，CS）是软骨素（Chondroitin，CH）的不同位置硫酸基取代产物，是由糖醛酸（葡糖醛酸GlcA/艾杜糖醛酸IdoA）、N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）及不同含量硫酸基组成[1]。其广泛存在于各种动物的软骨和结缔组织中，由于其来源不同，因此具有不同的结构和生理活性。大量研究表明，CS具有降血脂、抗动脉粥样硬化、增强免疫力、抗病毒性肝炎和抗肿瘤等活性，临床中已广泛应用于眼科、骨科、心血管疾病及口腔疾病等领域[2-5]。此外，大量研究表明，大部分多糖具有复杂的、多方面的抗氧化活性，而CS作为一种酸性黏多糖也具有一定的抗氧化能力，研究鲟鱼（Acipenser sinensis）CS的抗氧化活性对于CS的广泛应用具有重要意义。

由于天然的多糖相对分子质量大，较难透过生物细胞膜发挥其生理活性，因此，近年来，如何降低多糖的相对分子质量从而提高其生物利用率成为研究热点之一。目前，降低多糖相对分子质量的方法主要有生物降解、化学降解、物理降解和氧化降解。生物降解主要是酶法降解，其特点是安全高效，但成本较高；化学降解可分为无机酸和有机酸，无机酸降解简便易行，成本较低，但污染严重，而有机酸降解相对较安全，但不同的有机酸对多糖的降解效率差异较大；物理降解主要是超声波降解和辐照降解，其特点是降解过程易控制，无污染；氧化降解以过氧化氢降解为主，其特点是副产物较少，相对分子质量分布较为集中[6]。

本研究以自制的鲟鱼CS粗品为原料，分别采用化学降解、氧化降解和物理降解方法制备相对分子质量范围不同的CS，并比较不同降解方式所得的低分子质量CS的抗氧化性差异，为今后CS的进一步研究和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CS粗提物，湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所提供；98%D-葡萄糖醛酸，阿拉丁（上海）试剂有限公司；咔唑，化学纯，阿拉丁（上海）试剂有限公司；盐酸，分析纯，中国平煤神马集团开封东大化工有限公司试剂厂；硫酸，优级纯，信阳市化学试剂厂；DPPH，上海源叶生物科技有限公司；732型阳离子交换树脂，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、草酸、四硼酸钠，亚硫酸铁、水杨酸、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；30%过氧化氢，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

GL-21M型离心机，湘南湘仪实验室仪器开发有限公司；DF-101s型集热式恒温加热磁力搅拌器，上海东玺制冷仪器设备有限公司；DK-3600型电热恒温水浴锅，中化国科（北京）科技有限公司；DZ-300A型多功能真空分装机，温州市兴业机械设备有限公司；752型紫外可见光分光光度计，上海光谱仪器有限公司；BS124S型分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；PL3002（Ⅱ）型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；B-212型pH计，日本HORIBA公司；QE-100型中药粉碎机，浙江屹立工贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 低相对分子质量CS的制备将超微粉碎10 h的CS粗制品编号为cs；将cs配制成3%的溶液，并于60Co γ 18 kGy下进行辐照，浓缩冷冻干燥得产品cs-f；将cs置于0.4 mol/L HCl溶液中进行酸解（料液比为1∶30，g∶mL，下同），65 ℃水浴搅拌24 h，碱中和后浓缩冷冻干燥得产品cs-y；将10%的cs溶液置于10%的草酸体系中进行酸解，60 ℃水浴搅拌6 h，碱中和后浓缩冷冻干燥得产品cs-c；将cs置于0.6 mol/L 过氧化氢溶液中进行酸解（料液比为1∶40），80 ℃水浴搅拌24 h，碱中和后浓缩冷冻干燥得产品cs-h[7-10]。

1.3.2 纯化利用732型阳离子交换树脂对cs、cs-f、cs-y、cs-c和cs-h进行纯化，目的是得到纯度大于50%的CS寡糖。

树脂的预处理：①清水漂洗，至排水透明；②用蒸馏水浸泡12～24 h，使其充分膨胀；③用2倍体积1 mol/L HCl溶液浸泡12 h，并定时搅拌；④用低纯水洗涤树脂至其pH为4；⑤1 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，并水洗至微碱状态；⑥1 mol/L HCl溶液浸泡2 h，水洗至pH为6，超纯水浸泡待用。

过柱条件：将不同处理方式所得的低相对分子质量CS溶于蒸馏水中，配制成浓度为100 mg/mL的CS溶液10 mL。将预处理好的732型阳离子交换树脂装于2.5 cm×50 cm的层析柱中（为防止起泡和分层现象，将树脂置于适量的蒸馏水中匀速搅拌，并匀速装入柱中），装柱高度50 cm，将待层析的CS溶液加入柱中，并用蒸馏水进行洗脱，控制流速1 mL/min，将流出液收集，每5 mL为一管，测定每管收集液中产品含量，收集出峰区的液体，浓缩后进行冷冻干燥，得纯化后的产品[11]。

1.3.3 产品纯度

1）D-葡萄糖醛酸含量。D-葡萄糖醛酸含量采用硫酸-咔唑法[12]測定。

2）硫酸软骨素含量[13]。

1.3.4 体外抗氧化能力的测定

1）对DPPH·的清除能力。对DPPH·的清除能力的测定参照谢果凰[14]的方法，具体方法如下：将不同处理方式所得的低相对分子质量CS溶于蒸馏水，并根据其纯度配置成CS浓度依次为100、200、300、400、500 mg/mL的溶液，依次编号1、2、3、4、5。配制浓度为2×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液，按表1加反应液用力摇匀。将未加样品的DPPH·溶液，加入比色皿中进行吸光度的测定，记录吸光度为A0（用50%的乙醇溶液调零）。然后测出Ai、Aj所表示的样品的吸光度。清除率按公式（1）计算，重复3次。

式中，A0为未加样品溶液的DPPH溶液的吸光度；Ai为加入样品溶液后的DPPH溶液的吸光度；Aj为样品溶液自身的吸光度。

2）对·OH的清除能力。对·OH的清除能力的测定参照张莲[15]的方法，具体方法如下：将不同处理方式所得的低相对分子质量CS溶于蒸馏水，并根据其纯度配置成CS浓度依次为100、200、300、400、500 mg/mL的溶液，依次编号1、2、3、4、5。在试管中依次加入2 mmol/L的FeSO2溶液2 mL、6 mmol/L的水杨酸溶液2 mL，不同浓度的样品溶液2 mL，于37 ℃恒温水浴锅中反应15 min，最后加入6 mmol/L的H2O2溶液2 mL启动反应，摇匀，于37 ℃恒温水浴15 min后，在波长510 nm处测定吸光度，清除率计算方法如公式（2），重复3次。将样品溶液换成等体积的蒸馏水，测得其吸光度即为A0（蒸馏水调零）。

清除率=■×100% （2）

式中，A0为空白溶液对照；Ai为加入样品后的吸光度。

3）对Fe3+的还原能力。还原能力的测定参照李彦杰等[16]的方法，并略有改动，具体方法如下：将不同处理方式所得的低相对分子质量CS溶于蒸馏水，并根据其纯度配置成CS浓度依次为100、200、300、400、500 mg/mL的溶液，依次编号1、2、3、4、5，分别取1 mL依次加入pH 6.6的磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混匀后于50 ℃水浴20 min，然后加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，混匀，800 r /min离心10 min，取上清液2.5 mL，再次加入蒸馏水和0.1%氯化铁溶液各2.5 mL，混匀后静置10 min，在700 nm处测定吸光度。

2 结果与分析

2.1 相对分子质量

由表2数据可知，经上述方法降解后的产品相对分子质量至少可降低90%。比较各产品相对分子质量可知，过氧化氢氧化降解效果最好，不仅所得CS寡糖相对分子质量小，而且分散指数小，相对分子质量范围更窄；其后，依次为盐酸降解、草酸酸解和辐照降解。

2.2 不同降解方法制备的CS的抗氧化能力

2.2.1 对DPPH·的清除能力从图1可以看出，CS寡糖对DPPH·的清除能力呈现一定的剂量依赖性。5种CS寡糖中，经过氧化氢降解所得产品cs-h对DPPH·的抑制效果最好，其次是cs-y、cs-f，cs-c的抑制效果最差；当样品cs-h浓度为400 μg/mL时，清除率可达90%，继续增大浓度，抑制率不再增加，反而有所下降，说明已达剂量饱和状态。CS寡糖对DPPH·的清除能力的差异不仅与其处理方式有关，也与相对分子质量大小、硫酸基含量以及不饱和双键的形成有关，具体原因有待进一步研究。

2.2.2 对·OH的清除能力由图2可知，经过氧化氢氧化所得寡糖cs-h和经盐酸酸解所得寡糖cs-y呈现明显的剂量依赖性，且对·OH的清除能力明显强于其他寡糖。当寡糖cs-h的浓度为500 μg/mL时，其对·OH的清除率可达70%，当寡糖cs-y的浓度为500 μg/mL时，其对·OH的清除率可达65%。草酸酸解和辐照降解所得寡糖其对·OH的抑制效果不明显，分析可能与其处理方式和分子质量大小有关。

2.2.3 对Fe3+的还原能力由图3可知，不同处理方式所得CS寡糖对Fe3+的还原能力仅cs-h呈现明显的量效关系，其他几种方式处理所得CS产品对Fe3+的还原能力较弱，比较发现，盐酸处理后的产品还原能力大于辐照处理的，草酸处理后的最弱，但仍强于仅超微粉碎的产品，由此可知，CS对Fe3+的还原能力不仅仅与分子质量有关，与处理方式也有很大的关系，因此，可以通过分析不同处理方式的CS产品的结构差异（如硫酸基含量、不饱和双键等），来判断影响低分子质量CS还原能力的决定性因素。

将各产品相对分子质量及其对自由基的清除能力和Fe3+的还原能力结合分析发现，其抗氧化性并不是随着相对分子质量的降低严格增加的，且同一样品对不同自由基的清除能力和还原能力也有差异，相对分子质量对CS的抗氧化性有影响，但不是绝对影响，是与其他因素共同作用的结果。

3 小结与讨论

由试验数据可明显看出，经过氧化氢氧化所得CS寡糖cs-h不仅相对分子质量小，相对分子质量范围窄，且对DPPH·、·OH的抑制能力和对Fe3+的还原能力均为最优，且效果明显，浓度为500 μg/mL时，对DPPH·的清除率可达85%，对·OH的清除率可达70%；一定条件盐酸酸解效果稍弱，所得CS寡糖cs-y对DPPH·和·OH有明显的抑制作用，对Fe3+的还原作用相对较弱；草酸酸解和辐照降解不仅降解效果不明显，而且所得寡糖分散系数高，抗氧化性较弱。

有研究指出，CS寡糖的抗氧化性与其硫酸基含量、成分变化及不饱和双键的形成有关。孙涛等[8]人对κ-卡拉胶进行不同方式的降解，并比较其成分和体外抗氧化性发现，酸解会导致硫酸基含量的水解，對自由基的清除能力有所降低。张莲等[17]通过比较酶解和酸解CS寡糖发现，硫酸基含量对其体外抗氧化性无明显影响，而酸解过程中产生的不饱和糖醛酸对自由基清除能力和还原能力有积极作用。史敏娟等[9]通过比较过氧化氢+铜离子氧化体系降解和自由基降解CS发现，经过氧化氢体系所得寡糖氨基己糖、己糖醛酸和硫酸基含量等主要成分基本不变。根据试验数据，分析影响CS抗氧化性能的最主要因素是其分子质量大小，其次不同降解方式所得寡糖中不饱和双键的形成和其他成分的改变也可能造成抗氧化能力的差异，具体原因有待进一步研究。

参考文献：

[1] 于广利，赵峡，张天民，等.硫酸软骨素的结构特点及其质量控制[J].食品与药品，2010，12（5）：153-157.

[2] 林洪，姬胜利.硫酸软骨素的药理作用及应用进展[J].食品与药品，2006，8（12）：4-7.

[3] 孙丰梅，李兰会，李育峰，等.硫酸软骨素降血脂保健功能的研究[J].河北北方学院学报，2006，8（4）：46-51.

[4] 徐巨，孙涛，吕娟，等.硫酸软骨素对大鼠心肌膜微血管内皮细胞分泌IFN-γ的影响[J].中国畜牧兽医，2009，36（6）：42-44.

[5] 曹岳华，彭国庆，刘辉，等.硫酸软骨素在医学上的应用概况[J].中南药学，2010，8（3）：222-225.

[6] 陈蕾，吴皓.多糖降解方法的研究进展[J].中华中医药学刊，2008，26（1）：133-135.

[7] 谢捷，唐君敏，朱兴一，等.不同硫酸酯基含量硫酸软骨素的体外抗氧化活性[J].浙江工业大学学报，2010，38（6）：608-610.

[8] 孙涛，陶慧娜，周冬香.不同降解方式对k-卡拉胶低聚糖抗氧化活性的影响[J].食品与发酵工业，2009，15（7）：24-27.

[9] 史敏娟，熊双丽，王莹莹，等.低相对分子质量硫酸软骨素的制备及其性质[J].精细化工，2012，11（29）：1088-1093.

[10] 王俊，曾凡新，程微，等.低分子量鲟鱼硫酸软骨素的制备[J].湖北农业科学，2014，53（24）：6106-6110.

[11] 尹丽敏.油菜籽工艺水中多糖及油茶皂素的分离纯化研究[D].长沙：湖南农业大学，2013.