蛋白酶对豆乳凝胶过程流变学性质的影响研究

刘 贺 庚 平 李 君 朱丹实慧丽娟 王 勃 何余堂 马 涛

（渤海大学化学化工与食品安全学院1，锦州 121013）（辽宁省高校重大科技平台食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心2，锦州 121013）

蛋白酶对豆乳凝胶过程流变学性质的影响研究

刘 贺1，2庚 平1李 君1朱丹实1，2慧丽娟1，2王 勃1，2何余堂1，2马 涛1，2

（渤海大学化学化工与食品安全学院1，锦州 121013）（辽宁省高校重大科技平台食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心2，锦州 121013）

研究了4种蛋白酶对豆乳凝胶性质的影响。通过流变学恒温定量比较结果表明：菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶都具有凝胶能力，凝胶弹性模量（G′）最高可达10.28 Pa和5.27 Pa。升温可使菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶豆乳体系G′增强；且在40℃时，加入130 U／mL菠萝蛋白酶其豆乳体系G′达到最大值8.37 Pa；木瓜蛋白酶在高温下显示较强的凝胶能力；高温90℃时，含量较低的碱性蛋白酶（70 U／mL）豆乳体系G′达到最大值11.34 Pa；在豆乳体系中加入少量中性蛋白酶，其体系G′随着温度的升高先增强后降低，高添加量则相反。振荡频率扫描结果表明，不同体系G′均随频率的增加而增强，蛋白酶凝胶能力与其添加量有关。

蛋白酶 豆乳 凝胶 流变 弹性模量

大豆作为植物油和蛋白重要来源，是世界上最重要的油料作物［1］，也是我国主要经济作物之一。随着大豆优异的营养价值、功能性质以及生理活性越来越多地被认可和发掘，近年来大豆及豆制品在全球范围内受到了广泛的关注。豆乳被誉为是第二代牛乳，可用来制作豆乳酸奶、冰激凌、植物干酪等食品［2］，传统豆腐加工一般采用盐类凝固剂和酸凝固剂（如葡萄糖－δ－酸内酯），酶类凝固剂使用较为少见。但盐类凝固剂和酸凝固剂制得的产品存在一些问题，例如用卤盐制作的豆腐具有极佳的风味，但是豆腐持水性差，而且产品放置时间不宜过长；用石膏做成的豆腐保水性能好，组织光滑细腻，出品率高，但制品有一定的残渣而带有苦涩味，缺乏大豆香味；由内酯做成的豆腐品质较好，质地滑润爽口，弹性大，持水性好，但口味平淡，偏软，不适合煎炒，且略带酸味［3］。酶法凝固豆乳能够获得较好的凝块，口感细腻，条件较盐类凝固温和，容易控制［4］。更重要的是，酶类凝固剂还会在后期对大豆蛋白进行持续降解，从而降低硬度，改善口感［5］，是制备新型大豆食品的优良凝固剂。

已有研究表明，一些蛋白酶具有凝固豆乳的能力，不同的蛋白酶可能存在不同程度的肽键选择特异性，其作用效果也各不相同［6－9］。国外对豆乳凝固酶的研究较国内早些，Fuka等［10］和Matsuoka等［11］报道菠萝蛋白酶可促使大豆蛋白质凝固。Katsumi等［7］提出了某些商品微生物蛋白酶制剂具有使大豆蛋白质胶凝的功效，而国内对此研究较少。根据酶催化反应的一般原理，通过改变加酶量可以对酶反应速度进行有效的调控。因此，若能筛选出具有较高的促进豆乳凝胶能力的蛋白酶并确定酶用量，就可能将其作为新型豆乳凝固剂。目前对于豆乳凝固酶的凝固能力没有一个统一的评价标准，一般都是以凝固时间的长短来衡量凝乳能力的大小，这评价不够全面，还应从凝胶强度和弹性模量等流变学的角度来考察凝乳效果。因此需建立蛋白酶凝固豆乳流变学性质的研究方法，从而完善其凝固能力评价标准［12］。本研究比较了不同蛋白酶对豆乳体系流变性质的影响，并对不同蛋白酶之间酶促大豆蛋白形成凝乳过程的差异性进行研究。我国的大豆资源十分丰富，利用豆乳凝固酶开发新型的乳制品具有十分广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆：锦州市售优质黄豆；葡萄糖－δ－酸内酯（GDL）食品级：上海洛洛食品添加剂有限公司；菠萝蛋白酶（500 000 U／g）、木瓜蛋白酶（650 000 U／g）：南宁庞博生物工程有限公司；碱性蛋白酶（200 000 U／g）、中性蛋白酶（70 000 U／g）：北京鸿润宝顺科技有限公司。

1.2 主要仪器

DHR－1流变仪：美国TA公司。

1.3 试验方法

1.3.1 豆乳的制备

挑选优质大豆，称取一定量大豆，清洗后加3倍蒸馏水于室温下浸泡12 h，然后用干豆总量6倍的水磨浆（磨浆所用的水量扣除干豆所吸收的水分），得到的生浆经200目滤布双层过滤2次，之后加热到95℃保持10 min，然后迅速放入冰水中冷却，4℃保存备用。

1.3.2 4种蛋白酶促使豆乳胶凝能力的比较

将50mL豆乳加入到100mL烧杯中，在40℃的温度下水浴保温1 h，然后加入蛋白酶使其最终含量90 U／mL，搅拌均匀，将形成的混合液迅速加入流变仪的样品台进行流变性质测定。流变分析参数设定：夹具40 mm平行板；平行板间隙500μm；加样量1.0 mL；恒温40℃；频率扫描参数：频率1 Hz，应力1.0 Pa。

1.3.3 升温过程中对凝胶体系弹性模量的影响

将经过预热的豆乳分别与4种蛋白酶混合，蛋白酶添加量均为70、90、110、130 U／mL，将混合液迅速加入流变仪的样品平台进行流变性质测定，流变分析参数设定：夹具40 mm平行板；样品间隙1 000 μm；震荡扫描参数：升温扫描，40～90℃，10℃／min，频率1.0 Hz，应力1.0 Pa。

1.3.4 扫描频率对弹性模量的影响

将经过预热的豆乳分别与4种蛋白酶混合，蛋白酶添加量均为70、90、110、130 U／mL，将混合好的样品溶液迅速加入流变仪的样品台进行流变性质测定。流变分析参数设定：夹具40 mm平行板；样品间隙500μm；加样量1.0 mL；恒温40℃；频率扫描参数：频率0.01～1 Hz，应力1.0 Pa。

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶使豆乳胶凝能力的比较

为比较4种蛋白酶促进豆乳凝胶作用的强弱，测定在恒温40℃，相同蛋白酶添加量条件下，酶与豆乳中大豆蛋白质反应1 h过程中体系流变性质的动态变化如图1。反应至60 min后豆乳凝胶的流变学性质见表1。

图1 蛋白酶－豆乳体系弹性模量随时间的变化

表1 60 min时蛋白酶－豆乳凝胶的流变参数

G′为弹性模量，代表弹性部分，G′越高，样品的弹性越好，凝胶性质越好；G″为损耗模量，代表黏性部分。tgδ＝G″／G′，tgδ越大则体系表现为流体特征，反之则体系表现为固体特征，一般以tgδ＝1为界限［13］。如表1可知，在恒温40℃，60 min时，豆乳－菠萝蛋白酶和豆乳－碱性蛋白酶2种混合体系G′均大于G″，体系形成凝胶。由图1可知，菠萝蛋白酶豆乳体系随着时间的延长弹性模量显著增加，所形成的凝胶强度最高。Fuke等［11］研究表明，大豆11S球蛋白是蛋白酶凝固豆乳过程中起凝胶作用的主要物质，并推测疏水相互作用和二硫键可能对蛋白酶凝固豆乳形成凝胶起一定的作用。碱性蛋白酶豆乳体系弹性模量随着时间的延长先呈增加趋势，但始终低于菠萝蛋白酶。这是因为在短时间内，豆乳中的大豆蛋白在碱性蛋白酶（90 U／mL）的作用下部分水解造成蛋白质表面疏水性的增加，导致大豆蛋白以11S为骨架，形成蛋白质分子球，小的蛋白球再聚集形成大的“蛋白球群”，最后这些蛋白球群相互连接形成网络结构成为凝胶。在蛋白球的聚集过程中，分子间氢键作用增强，使凝胶强度增强并稳定凝胶结构。随着时间的延长，大豆蛋白的过度水解，难以形成凝胶，则弹性模量逐渐下降。而木瓜蛋白酶和中性蛋白酶豆乳体系在相同条件下，蛋白酶的水解能力始终大于凝乳能力，所以豆乳没有形成凝胶，体系弹性模量较小。

2.2 升温过程对凝胶体系弹性模量的影响

如图2所示，升温过程中，菠萝蛋白酶豆乳体系的弹性模量随着温度的升高而增加，木瓜蛋白酶豆乳体系在高温条件下弹性模量显著增加，碱性蛋白酶和中性蛋白酶豆乳凝胶体系，温度变化对不同蛋白酶含量的豆乳体系影响不同，绝大部分样品的弹性模量始终远远大于损耗模量，且弹性模量可以更好地反馈凝胶形成的过程，因此本研究主要观察分散体系的弹性模量［14］。

如图2a所示，在55℃之后，菠萝蛋白酶豆乳体系弹性模量缓慢增加，且菠萝蛋白酶加入量越大，体系弹性模量越大。这是由于菠萝蛋白酶适宜水解温度范围为40～60℃，适宜凝豆乳温度范围在70～80℃。蛋白质肽链的水解是豆乳凝固的前提，蛋白酶作用使肽链断裂，蛋白质空间结构发生变化，随后断裂的肽链在酶的作用下重新结合［15］，并通过二硫键和疏水相互作用形成凝胶。如图2b所示，木瓜蛋白酶豆乳体系在40～80℃之间，其弹性模量趋于平行。在80℃以后，其系弹性模量显著增加，加入量90 U／mL时凝胶体系弹性模量增加最快。原因是木瓜蛋白酶是一种耐热性的酶，最适凝乳温度较其它蛋白酶高（一般为70～90℃），当温度达到90℃，大豆蛋白暴露出更多的疏水基，有利于豆乳胶凝作用，其凝固机理与菠萝蛋白酶相似［16］。此外，在80～90℃范围内，其豆乳体系弹性模量由大至小排列为：90、110、130、70 U／mL，这是因为当蛋白酶加入量较小时，反应过慢，大豆蛋白水解程度较低，未能达到形成凝胶的最佳展开程度，所形成凝胶强度不够高；酶添加量过大，则大豆蛋白降解成短肽速度过快，展开的大豆蛋白未能来不及形成凝胶，不能形成很好的凝胶；而在酶加入量适中时，大豆蛋白水解和展开并形成凝胶同时进行，形成凝胶较好［17］。所以本研究在木瓜蛋白酶加入量为90 U／mL时豆乳凝胶体系弹性模量较高。图2c为温度变化对碱性蛋白酶凝豆乳体系弹性模量的影响。温度及碱性蛋白酶含量对凝胶体系弹性模量影响较大，蛋白酶含量越低，凝胶体系弹性模量达到最大时所需温度越高。蛋白酶加入量为70 U／mL，90℃时，体系弹性模量G′达到最大11.34 Pa，而蛋白酶加入量为130 U／mL，40℃时，体系弹性模量G′达到最大4.55 Pa。原因是低蛋白酶含量的豆乳体系，随着温度的升高，蛋白质的水解速度适宜，这一方面可以保持肽链足够的长度，另一方面破坏蛋白质的分子结构，使球蛋白质分子内的疏水侧链暴露，并通过疏水相互作用形成凝胶［11］，弹性模量显著增加；当蛋白酶含量较高时，蛋白质将会过度水解，难以形成凝胶，则弹性模量逐渐下降。图2d为温度的变化对中性蛋白酶豆乳体系弹性模量的影响，中性蛋白酶在添加量较低（70、90 U／mL）时，体系弹性模量随着温度的升高先增加后下降，而在添加量较高（110U／mL、130U／mL）时，体系弹性模量均随着温度的升高而缓慢下降，究其原因仍是由于高的蛋白酶含量会加快蛋白质水解速度，不利于豆乳凝胶。

图2 升温过程中不同酶的添加量对凝胶体系弹性模量的影响

2.3 扫描频率对弹性模量的影响

图3 不同频率扫描下不同酶的添加量对凝胶体系弹性模量的影响

将豆乳凝胶体系在40℃条件下进行频率扫描，观察扫描频率的变化对弹性模量的影响。如图3所示，扫描频率对弹性模量的影响较为明显，且不同蛋白酶凝胶体系差异显著。在低频区，弹性模量随扫描频率的升高而缓慢增强，表现出典型的黏弹性材料的性质，当频率继续升高，弹性模量多数呈明显增强趋势。蛋白酶在一定含量范围内，豆乳凝胶体系弹性模量随着扫描频率的增加而增强，蛋白酶凝胶能力与加入量的大小有关。其中，菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶添加量分别为90、130、70、70 U／mL时，豆乳体系弹性模量升高速率最快，其最高弹性模量分别为148.38、23.06、93.52、13.96 Pa。同时，菠萝蛋白酶豆乳体系弹性模量整体偏高，其次为木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，而中性蛋白酶凝胶体系弹性模量较低。

3 结论

3.1 在恒温40℃、蛋白酶添加量为90 U／mL条件下，菠萝蛋白酶和碱性蛋白酶都具有凝固豆乳的能力，其中菠萝蛋白酶凝胶能力较强，而在相同条件下木瓜蛋白酶和中性蛋白酶没有促凝豆乳的能力。

3.2 升温过程中，菠萝蛋白酶含量在130 U／mL的豆乳体系G′曲线较高；高温（90℃）下，加入少量碱性蛋白酶（70 U／mL）的豆乳体系中G′值最大；中性蛋白酶含量较低的豆乳体系G′随着温度的升高先增强后下降，高添加量则相反；木瓜蛋白酶在高温下显示较强的凝胶能力。

3.3 振荡频率扫描结果表明，不同体系弹性模量均随频率的增加而增强，表现出黏弹性体的典型特征，蛋白酶凝胶能力与其加入量有关。在一定条件下，菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶凝胶效果较好，可以作为豆乳的凝固剂，中性蛋白酶凝胶效果相对较弱。

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Effect of Protease on the Rheological Properties of Soybean Milk Gel Process

Liu He1，2Geng Ping1Li Jun1Zhu Danshi1，2Hui Lijuan1，2Wang Bo1，2He Yutang1，2Ma Tao1，2
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University1，Jinzhou 121013）（Engineering and Technology Research Center of Food preservation，Processing and Safety Control of Liaoning Province2，Jinzhou 121013）

The effects of four kinds of proteases on soymilk gel properties have been studied.Through the rheological thermostatic quantitative comparison，the results indicated that both bromelain and alcalase had coagulation ability，elastic modulus of the soymilk system reached themaximum of 10.28 Pa and 5.27 Pa respectively.Increasing temperature would enhance the elasticmodulus of the bromelain and alcalase soymilk system.Adding 130 U／mL bromelain could lead the elasticmodulus to reach themaximum of8.37 Pa at40℃.Papain showed a strong coagulation ability at high temperature.Adding 70 U／mL alcalase，the elastic modulus of the soymilk system reached the peak value of 11.34 Pa at 90℃；Adding a low amount of neutral protease in the soymilk system along with the raising temperature，the elasticmodulus of the soymilk increased at first and then decreased，butgot the inverse resultat high addition of neutral protease could get.The results of oscillation frequency sweep indicated that elasticmodulus of the soymilk enhanced along with increasing frequency，and gelation capacity of proteases was related to its additive amount.

protease，soybean milk，gelation，rheological，elasticmodulus

TS201.7

A

1003－0174（2015）03－0106－05

国家自然科学基金（31201385），锦州市科学技术计划（12A1B27）

2013－12－03

刘贺，男，1979年出生，副教授，食品大分子的结构与功能及其修饰