响应面法优化小米红曲制备工艺及其抗肿瘤活性研究

张秀媛 何 扩 石 后 穆光达

（河北北方学院食品科学系河北北方学院食品科学研究所，张家口 075131）

响应面法优化小米红曲制备工艺及其抗肿瘤活性研究

张秀媛 何 扩 石 后 穆光达

（河北北方学院食品科学系河北北方学院食品科学研究所，张家口 075131）

以小米为原料，研究制备小米红曲工艺及其抗肿瘤活性。采用响应面法对固态发酵小米红曲制备的工艺进行优化，并对制备的小米红曲进行了体内外抗肿瘤活性分析。结果表明，小米红曲制备的最佳条件为：初始水分含量为42%、发酵温度为28℃、发酵时间为14 d。小米红曲350mg／kg／d对小鼠肝癌H22实体瘤体内有明显的抑制作用，其抑瘤率在30%以上；小米红曲对H460、A549癌细胞体外亦有明显的增殖抑制作用抑瘤；给药方式以局部注射最好。表明小米红曲在体内外均具有一定的抗肿瘤活性。

小米红曲 固体发酵 Box－Behnke 抗肿瘤

红曲是红曲霉（M.spurpureus）在生长代谢过程中产生的蒽醌衍生物，不仅应用于酿酒、腐乳、食醋、食品色素等食品工业，而且具有能降低血压、抑制胆固醇、提高人体免疫力、抑瘤抗癌等功效［1］。传统红曲采用籼米接种红曲霉经固体发酵而制得，而采用小米为原料生产的红曲具有色价高、质量好、发酵周期短等优点。我国北方盛产小米（Setaria italica），小米的食用性单一，因此利用小米生产红曲是小米深加工的一种理想方法，不仅可以增加小米的附加值，而且可以生产出高质量的红曲。

本研究采用响应面法首先对固态发酵制备小米红曲的小米饭的初始含水量、发酵温度、发酵时间的选择进行了优化，获得此技术制备小米红曲的最佳工艺条件，然后采用C56BL／6小鼠为模型，系统研究了制备的小米红曲对H22实体瘤体内抑制以及对H460、A549癌细胞体外抑制活性研究，以期为小米红曲的开发利用提供理论和实际指导。

1 材料与方法

1.1 材料

红曲霉：古田县生华红曲有限公司；小米：宣化巡天种业公司；PDA培养基：连云港迈克化工有限公司；环磷酰胺：南通制药厂；5－氟脲嘧啶（5－Fu）：上海旭东海普药业有限公司；MTT（噻唑蓝）：北京赛驰生物科技有限公司。

小鼠肝癌H22：中国科学院上海药物研究所；肿瘤H460、A549细胞：中国科学院细胞生物研究所；C56BL／6小鼠：斯莱克动物中心。

1.2 主要仪器

752紫外光栅分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；5410型二氧化碳培养箱：NAPCO公司。

1.3 试验方法

1.3.1 小米红曲的制备［2］

将小米浸泡18 h，沥干水，待水煮沸后，再将小米倒入蒸格内，圆气后蒸1 h至小米熟透无生心，然后将小米摊凉并打散。称取一定量的小米放入150 mL三角瓶中，加入10%孢子悬浮液在一定温度下进行恒温培养，接种72 h后每24 h加8%水并摇瓶，培养一定时间后，取出，在100℃下烘干，并测色价。

1.3.2 红曲米色价的测定

采用GB 4926—2008［3］测定小米红曲色价。

1.3.3 响应面分析法优化试验

在单因素试验的基础上，建立响应值与影响因素间的数学模型，确定制备小米红曲最佳条件。

1.3.4 小米红曲抗肿瘤活性测定

1.3.4.1 体内抑瘤试验

分别设阴性对照组、小米红曲250、350、450、环磷酰胺（阳性组）20mg／kg／d组。取H22肉瘤小鼠腹水，0.2 mL／只接种于C56BL／6小鼠右侧腋下，接种后随机分组，第2天起每天灌胃给药，各组给药体积均为0.3 mL／10 g体重，阴性对照组灌胃相同体积的生理盐水。试验第15日处死动物，取瘤称重。按下式计算抑瘤率。

式中：A为阴性对照组平均瘤重；B给药组平均瘤重。

1.3.4.2 体外抑瘤试验

将0.8×105个生长至对数生长期的人肿瘤H460、A549细胞接种于96孔板，每孔80μL，同时加入不同剂量的小米红曲溶液，每孔20μL，另设阴性对照组每孔加20μL培养液，阳性对照组加入20μL 5－Fu（5－氟脲嘧啶），使5－Fu的终浓度为10 μg／mL。将96孔板置5%CO2培养箱（37℃）培养48 h，然后每孔加入噻唑蓝溶液10μL，继续培养4 h，离心后吸弃上清液。用酸化10%十二烷基磺酸钠100 μL中止反应，放置12 h后于570 nm处测定OD值。按下式计算抑制率，通过抑制率对药物浓度作直线回归方程，计算出IC50。

式中：C为阴性对照组OD均值；D为药物处理组OD均值。

1.3.4.3 不同给药方式对体内抑制肿瘤的效果

取H22肉瘤小鼠腹水，0.2 mL／只接种于基本相同体重的C56BL／6小鼠右侧腋下，接种后随机分成灌胃、局部注射、腹腔注射3个组，将小米红曲按大、中、小剂量（220、320、420mg／kg／d）给药，各组给药体积均为0.3 mL／10 g体重，阴性对照组灌胃相同体积的生理盐水。试验第15天处死小鼠，迅速剥离各试验组肿瘤组织，取瘤称重。抑瘤率计算按照步骤1.3.4.2。

1.4 数据分析

取3次试验数据，数据以±s表示，用SPSS软件作单因子方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 初始含水量对固体发酵制备小米红曲的影响

装料量为15 g、发酵温度30℃、发酵时间为9 d的情况下，研究了小米饭初始水分含量对固体发酵制备小米红曲的影响，结果见图1。随着小米饭初始含水量的增加小米红曲的色价升高，含水量45%时红曲色价最高，此后色价越来越低。原因是小米饭含水量过高，导致小米饭处于黏糊状态，体系通氧困难，影响霉菌生长生产红曲色素。

图1 初始含水量对小米红曲色价的影响

2.1.2 装料量对固体发酵制备小米红曲的影响

发酵温度30℃、初始含水量45%、发酵9 d的情况下，研究了装料量对固体发酵制备小米红曲的影响，见图2。在150 mL锥形瓶中，底物量为9～21 g时，对固体发酵制备小米红曲的影响较小（P＞0.05），但是超过21 g后，小米红曲的色价明显降低，且在发酵过程中小米结块并有异味产生。增多的底物量阻止红曲霉呼吸氧气，导致产色能力降低。

图2 底物量对固体发酵制备小米红曲的影响

2.1.3 发酵温度对固体发酵制备小米红曲的影响

装料量15 g、初始含水量45%、发酵时间9 d的情况下，研究了发酵温度对固体发酵制备小米红曲的影响，见图3。发酵温度为25～30℃时，发酵良好；发酵温度为20℃时，红曲霉生长缓慢，并有杂菌生长；发酵温度为35、40℃时，红曲霉难以生长，可能是过高的温度不适合红曲霉的生长，并且过高的温度使得水分蒸发过快，导致红曲霉在生长过程中缺水。

图3 发酵温度对固态发酵制备小米红曲的影响

2.1.4 发酵时间对固体发酵制备小米红曲的影响

装料量15 g、发酵温度30℃、初始含水量45%的情况下，研究发酵时间对固体发酵制备小米红曲的影响，见图4。发酵初期底物颜色不断变深，到发酵6 d后底物表面颜色不再变深，但是通过测色价发酵6 d后色价还在不断明显增高（P＜0.05），直到发酵15 d后色价增加不明显（P＞0.05）。

图4 发酵时间对固体发酵制备小米红曲的影响

2.2 响应面分析法优化工艺条件

综合单因素试验结果，在150 mL锥形瓶中装料量在9～21 g范围内对小米红曲色价影响不显著，所以试验采用三因素三水平进行分析（见表1），以1、2、3为自变量，小米红曲色价Y为响应值，响应面分析方案及结果见表2，根据表2通过Design－Expert8.0统计软件对响应面回归过程进行数据分析，建立响应面的回归模型，分析结果见表3。

由表3知，初始水分含量和发酵时间一次项、初始水分含量、发酵时间二次项达到极显著水平（P＜0.01），发酵温度一次项达到显著水平（P＜0.05），各项因素对提取率的影响经回归拟合后得到二次多项回归模型，Y＝2 648.37－570.61X1－156.53X2＋717.88X3－116.55X1X2－375.24X1X3－31.98X2X3－1 204.65X12－310.80X22－403.05X32，该方程的相关系数R2＝0.977 0，整体模型P＜0.01，表明该二次方程模型达到极显著，失拟项P＝0.051 2＞0.05，表明方程实拟不显著。该方程对试验拟合较好，模型能够用于预测真实的试验数据。通过Design Expert 8.0分析得出最佳制备小米红曲条件为初始含水量42%、发酵温度28℃、发酵时间14 d。在此条件下发酵制备的小米红曲色价预测值为3 116.39 u／g。

表1 Box－Benhnken试验设计因素和水平

表2 响应面试验设计方案及试验结果

表3 响应面二次回归方程方差分析

根据响应面试验获得的最佳工艺结果，在此条件下进行验证试验。平行测定3次所获小米红曲色价平均值为3 114.2 u／g，试验值与预测值接近。

2.3 小米红曲抗肿瘤活性测定

2.3.1 体内抑瘤活性结果

体内抑瘤试验结果表明小米红曲各剂量组对小鼠肝癌H22均有一定的抑制作用，与肿瘤阴性对照组相比，差异具有显著性（P＜0.01，P＜0.05），350mg／kg／d组的抑制率为38.32%，450mg／kg／d组的抑制率分别为41.5%（见表4）。

表4 小米红曲对小鼠肝癌H22的影响（±s，n＝10）

表4 小米红曲对小鼠肝癌H22的影响（±s，n＝10）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别剂量／mg·kg－1 ·d－1）动物数（前／后）动物体重／g（前／后）瘤重／g抑瘤率／% P值 显著性**小米红曲 350 10／10 22.1／27.2 0.84±0.28 38.32 0.030* 250 10／10 22.1／26.7 0.88±0.37 26.71 0.620 CTX 20 10／10 20.1／24.2 0.54±0.20 45.31 0.002**阴性对照组生理盐水450 10／9 22.1／26.8 0.73±0.32 41.50 0.006 10／10 21.3／26.3 1.32±0.52

2.3.2 体外抑瘤活性结果

与阴性对照组相比，不同浓度的小米红曲体外对H460、A549癌细胞均有明显的增殖抑制作用（P＜0.01，P＜0.05），IC50分别为65.1、56.4μg／mL（见表5）。

表5 小米红曲对H460、A549癌细胞增殖的影响（±s，n＝10）

表5 小米红曲对H460、A549癌细胞增殖的影响（±s，n＝10）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量／μg／mL OD570 nm H460 A549小米红曲 340 0.21±0.03** 0.25±0.05** 300 0.34±0.04** 0.31±0.02** 260 0.39±0.05** 0.41±0.05** 220 0.50±0.02** 0.48±0.03** 180 0.53±0.03* 0.52±0.04* 150 0.58±0.06* 0.56±0.05* 5－Fu 10 0.14±0.04** 0.23±0.02**阴性对照组 培养液0.74±0.03 0.67±0.03

2.3.3 不同给药方式对体内抑制肿瘤的效果

不同给药方式对体内抑制肿瘤的效果结果（见图5），从图5可以看出，3种给药方式的抑瘤率都与剂量呈正相关，相同剂量下3种给药方式抑瘤率效果大小为局部注射＞腹腔注射＞灌胃。采用局部注射给药方式红曲直接被吸收进入血液产生作用，而腹腔注射和灌胃首先进入肠道刺激肠道影响吸收，这些说明小米红曲作为抑瘤剂具有时间和剂量依赖性，这与有关文献报道一致［7－8］。

3 结论

3.1 研究了初始含水量、装料量、发酵温度、发酵时间对小米红曲制备效果的影响，在150 mL锥形瓶中装料量在9～21 g范围内对小米红曲色价影响不显著，通过响应面分析得出最佳提取条件为：初始含水量为42%；发酵温度为28℃；发酵时间为14 d。

图5 不同给药方式和不同剂量对抑瘤率的影响

3.2 体内抑瘤试验表明：小米红曲250、350、450mg／kg／d对小鼠肝癌H22实体瘤都有抑制作用，当剂量≥350mg／kg／d时，其抑瘤率在30%以上，试验重现性良好且差异显著；体外抑瘤试验表明：小米红曲对H460、A549癌细胞亦有明显的增殖抑制作用，表明小米红曲在体内外均具有一定的抗肿瘤活性；给药方式试验表明：以局部注射方式抑制体内肿瘤效果最好，同时表明小米红曲作为抑瘤剂具有时间和剂量依赖性。

［1］田莉，程剑峰.红曲的生产及其应用［J］.农产品加工，2003，6（5）：24

［2］刘颖.红曲色素的固态发酵法制取技术及其稳定性研究［D］.长沙：湖南农业大学，2006

［3］GB 4926—2008，食品添加剂红曲米（粉）［S］

［4］盖栋梁.低橘霉素高色价红曲霉固态发酵研究［D］.贵州：贵州大学，2006

［5］赵树欣，陈云，贾思，等.界面上红曲霉的生长及Monacolin K的产生［J］.食品与发酵工业，2003，29（5）：11－14

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［7］武巧莉，姜达.洛伐他汀对人卵巢SKOV3细胞株的体外作用及其机制研究［D］.石家庄：河北医科大学，2009

［8］Akihisa T，Tokuda H，Ukiya M，et al.Anti－tumor initiatingeffects ofmonascin，an azaphilonoid pigment from the extract of Monascus pilosus fermented rice（red－moldrice）［J］.Chemistry Biodivers，2005（2）：1305－1309

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Optimization of Production of Millet Red Rice Using
Response Surface Methodology and Their Antitumor Activity

ZhangXiuyuan He Kuo Shi Hou Mu Guangda
（Department of Food Science，Hebei North University，Institute of Food Science Hebei North University，Zhangjiakou 075131）

Optimization ofmillet red rice production was studied by response surfacemethodology and their antitumor activity was also determined.The results showed that the optimum production conditions were initialmoisture content42%，fermentation temperature 28℃and time 14 days.The inhibition ratio could reach over 30%when mice was treated by pressuremillet red rice at350mg／kg／d andmillet red rice could significantly inhibit cell growth of H460 and A549 cancer cell as to H22.The result showed that the local injection was the best feeding pattern.The three experiments all indicated thatmillet red rice had antitumor activityin vivoandin vitro.

millet red rice，solid－state fermentation，Box－Behnken，antitumor

TS218

A

1003－0174（2015）03－0019－05

张家口市科技攻关计划（1012005C－10）

2013－11－04

张秀媛，女，1982年出生，讲师，农副产品加工与保藏