富硒玉米肽对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

张 岩 何 慧 张久亮 王 驰 侯 焘

（华中农业大学食品科学技术学院环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070）

富硒玉米肽对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

张 岩 何 慧 张久亮 王 驰 侯 焘

（华中农业大学食品科学技术学院环境食品学教育部重点实验室，武汉 430070）

研究富硒玉米肽对四氯化碳（Carbon tetrachloride，CCl4）诱导的小鼠肝损伤的保护作用。将健康的雄性昆明小鼠70只，随机分成7组：正常对照组、CCl4模型组、富硒玉米肽低、中、高剂量组（100、200、400mg／kg·bw）、普通玉米肽组（200mg／kg·bw）、水飞蓟素阳性对照组（50mg／kg·bw），每组10只。测定比较血清中谷丙转氨酶（ALT）活力、谷胱甘肽（GSH）、三酰甘油（TG）含量，同时测定肝组织中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）的含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力，肝脏指数，并观察肝组织病理学变化。结果显示富硒玉米肽低、中、高剂量组均能极显著抑制CCl4致肝损伤小鼠血清ALT活性和TG含量的升高、GSH含量的降低（P＜0.01）；均能极显著提高肝组织中GSH含量和SOD、GSH－Px活力，并降低肝组织中MDA的含量（P＜0.01），极显著降低由于肝损伤引起的肝脏肿大（P＜0.01），改善肝组织损伤程度，并存在剂量效应关系。富硒玉米肽高剂量组的护肝效果与50mg／kg·bw的水飞蓟素相当，相同剂量的富硒玉米肽的保肝作用极显著优于普通玉米肽（P＜0.01）。结果表明富硒玉米肽对CCl4所致小鼠急性肝损伤有显著的保护作用，且与普通玉米肽相比，富硒玉米肽的有效保肝剂量显著降低。

富硒玉米肽 CCl4肝损伤模型 保肝

硒是人和动物体必需的微量元素，是人体内多种硒蛋白的必需成分，具有抗氧化［1，2］、抗癌［3］、提高机体免疫力［4］、预防心脑血管疾病［5］、保肝［6］等诸多生理功能。其中最突出的作用是抗氧化，硒可以作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）的活性中心，清除体内过多的活性氧自由基和过氧化物，此外机体内大量存在的非酶硒化合物也能直接捕获脂质自由基（R·）及过氧化脂质自由基（ROO·），从而起到抗氧化作用［7］。硒的抗氧化作用及其与肝病的关系已有一些报道，预防性补硒可以降低肝炎的人群发病率，阻断慢性肝病向肝癌转化［8］。与无机硒相比，生物转化的有机硒因其安全性、补硒效率高而备受青睐。

近年来，国内外学者已从酶解玉米蛋白制备玉米活性肽，并发现其具有降血压［9］、抗疲劳、抗氧化［10］、促进酒精代谢［11］、防治肝性脑病［12］等生理功能。本实验室曾对醒酒保肝玉米肽的制备、活性、机理及结构进行了较系统地研究，结果显示玉米肽对酒精性肝损伤［13］、半乳糖胺致肝损伤［14］、卡介苗与脂多糖诱导的小鼠免疫性肝损伤［15］都具有良好的保护作用。鉴于硒具有较强的抗氧化能力，而玉米肽又具有较好的保肝活性，本研究以富硒玉米肽为研究对象，以期利用硒和玉米肽的双重功效协同保肝。CCl4诱导的肝损伤模型是一种常用的化学性肝损伤的动物模型，用来研究保肝药物和其他物质对肝细胞损伤的保护作用。水飞蓟素是指从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取得到的一种黄酮木脂素类化合物，长期被用于临床治疗肝脏疾病，因此，在试验中常作为阳性对照药物。本实验室的前期研究显示与普通玉米肽相比，富硒玉米肽的醒酒效果更为显著［16］，因此本试验采用小鼠CCl4急性肝损伤模型，通过测定血清中谷丙转氨酶（ALT）活力、谷胱甘肽（GSH）和三酰甘油（TG）含量，同时测定肝组织中丙二醛（MDA）和GSH含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）的活力、肝脏指数，并观察肝组织病理学变化，评价富硒玉米肽对小鼠的保肝作用，为进一步开发利用富硒植物蛋白资源，提高其附加值提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料

富硒玉米：湖北省恩施土家族苗族自治州双河乡；普通玉米：市售；富硒玉米肽、普通玉米肽均由本实验室自制［16］。制得的富硒玉米肽和普通玉米肽的粗蛋白质量分数分别为63.15%、63.30%，硒含量分别为6.19、0.02μg／g。

1.1.2 主要试剂

谷丙转氨酶（ALT）、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）、考马斯亮兰试剂盒：南京建成生物工程研究所；三酰甘油（TG）试剂盒：上海名典生物工程有限公司；水飞蓟素（Silymarin）：德国马博士大药厂；碱性蛋白酶（Alcalase 3.0T）：丹麦诺维信公司；硒标准溶液（1 000μg／mL）：天津市光复精细化工研究所；CCl4：上海国药集团；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器

UV－102－02WF紫外可见分光光度计：日本Shimadzu公司；Prepscale 1.6 L超过滤系统：美国MILLIPORE公司；HPIAS高清晰度彩色病理图文分析系统：华海医疗信息技术股份有限公司；LGJ－12冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；全波长酶标仪：美国Thermo Fisher Scientific公司；AFS－8220型原子荧光光度计：北京吉天仪器有限公司。

1.1.4 试验动物

昆明种小鼠：体重（18～22）g，雄性，购于湖北省疾病预防控制中心试验动物中心。许可证号：SCXK（鄂）2008－0005。

1.2 试验方法

1.2.1 富硒玉米肽、普通玉米肽的制备［16］

取适量富硒玉米蛋白粉，配成质量浓度为2.86 g／100mL的水溶液，沸水浴处理30 min，调温度至60℃、调pH值至8.00，按所用玉米蛋白粉质量的0.6%加入Alcalase碱性蛋白酶，边搅拌边不断加入0.1 mol／L的NaOH溶液，维持pH 8.00直至pH值不再变化，取出烧杯冷却至室温，选用截留分子质量为5 ku的再生纤维素卷式超滤膜进行超滤分离，将膜透过物浓缩冻干后备用。普通玉米肽的制备方法同上。

1.2.2 小鼠CCl4急性肝损伤模型的建立［17］

将70只昆明种雄性小鼠随机分成7组，每组10只，分别为正常对照组、CCl4模型组、富硒玉米肽低、中、高剂量组、普通玉米肽组、阳性对照水飞蓟素组。各组均以小鼠标准饲料喂养，自由饮水。参考本实验室普通玉米肽的研究结果［17］以及预试验确定的肽灌胃剂量，室温25℃下适应1周后，正常对照组和CCl4模型组按每日定时10 mL／kg·bw灌胃生理盐水1次，富硒玉米肽低、中、高剂量组每日分别按100、200和400mg／kg·bw（硒含量分别为0.62、1.24、2.48 μg／kg·bw）剂量灌胃富硒玉米肽1次，普通玉米肽组每日按200mg／kg·bw剂量灌胃普通玉米肽1次，阳性对照组按每日50mg／kg·bw剂量灌胃水飞蓟素1次。连续灌胃15 d，于末次给药4 h后，各组按10 mL／kg·bw的量腹腔注射0.125%CCl4的溶液（溶于橄榄油中），正常对照组则腹腔注射等体积的生理盐水。禁食16 h（不禁水）后，眼球取血处死小鼠，剖腹取出肝脏，生理盐水漂洗后，取肝一叶制肝匀浆，另一叶用10%福尔马林溶液固定供组织病理学切片用。在整个饲养周期内，每2 d称1次体重，所有小鼠体重均呈增长趋势，组间无显著性差异。本研究中实验动物的使用严格遵守GB 14925—2001。

1.2.3 生化指标检测

按试剂盒说明书方法分别测定血清中ALT活力、GSH、TG含量，肝组织匀浆中GSH、MDA含量、SOD、GSH－Px活力。

1.2.4 肝脏指数的测定

各组小鼠称重后处死，取肝脏，用预冷的生理盐水清洗，滤纸吸去血液，称湿重。计算肝脏指数［18］。

肝脏指数／mg／g＝肝脏质量（mg）／体重（g）

1.2.5 数据统计与分析

试验数据用SPSS 19.0统计软件包中的单因素方差分析和Duncan氏多重比较，P＜0.01表示差异极显著。试验结果以平均值±标准差（X±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 富硒玉米肽对CCl4致肝损伤小鼠血清中ALT、GSH、TG的影响

由表1可以看出，与正常对照组比较，模型组小鼠的血清中ALT活性、TG含量极显著增高，GSH含量极显著的降低（P＜0.01），从以上生化指标来看，CCl4诱导的肝损伤造模成功。灌胃富硒玉米肽后，ALT活力、TG含量极显著降低、GSH含量极显著升高（P＜0.01），并且富硒玉米肽低、中、高各剂量组间呈现出明显的剂量－效应关系。高剂量组的各项指标与阳性对照组水飞蓟素（50mg／kg·bw）的效果相当。高剂量组GSH含量、ALT活性、TG含量与阳性对照组组间无显著性差异。与等剂量的普通玉米肽组相比，中剂量富硒玉米肽组的ALT活性、TG含量极显著降低，GSH含量极显著升高（P＜0.01）。

表1 富硒玉米肽对CCl4肝损伤小鼠血清中ALT、GSH、TG的影响

表2 富硒玉米肽对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆中GSH、MDA、SOD、GSH－Px的影响

2.2 富硒玉米肽对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆中GSH、MDA、SOD、GSH－Px的影响

由表2可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠肝组织中的MDA含量、SOD活性、GSH含量、GSH－Px活性有极显著差异。与模型组相比，富硒玉米肽各剂量组的SOD、GSH含量、GSH－Px活性均极显著升高，MDA含量极显著降低（P＜0.01），并且呈现一定的剂量－效应关系。与阳性对照组水飞蓟素组相比，灌胃高剂量组的富硒玉米肽后，小鼠肝组织中的GSH含量有极显著的升高（P＜0.01）。与普通玉米肽组相比，等剂量的富硒玉米肽组GSH含量、SOD活性极显著升高（P＜0.01）。

2.3 富硒玉米肽对CCl4肝损伤小鼠肝脏指数的影响

由表3可以看出，与正常对照组相比，模型组的肝脏指数极显著增大（P＜0.01）。与模型组相比，富硒玉米肽中、高剂量组肝脏指数极显著降低。与普通玉米肽相比，等剂量的富硒玉米肽的肝脏指数与之有极显著的差异（P＜0.01），400mg／kg·bw富硒玉米肽组的肝脏指数与阳性对照组50mg／kg·bw水飞蓟素相当。

表3 富硒玉米肽对CCl4致肝损伤小鼠肝脏指数的影响

总体来说，200mg／kg·bw的普通玉米肽与100mg／kg·bw的富硒玉米肽的保肝效果相当，提示硒的协同增效作用可以使玉米肽的有效保肝剂量大大降低。

2.4 小鼠肝组织病理学检查

图1 富硒玉米肽对CCl4诱导肝损伤小鼠肝组织形态学变化的影响

小鼠肝组织病理学切片如图1所示。镜检观察到正常对照组肝小叶结构清晰，肝细胞索以中央静脉为中心呈放射状排列、肝窦结构规整，中央静脉周围未见炎性细胞浸润（见图1a）；CCl4模型组肝细胞排列紊乱，围绕中央静脉周围许多块状坏死灶，炎性细胞浸润明显，大部分细胞核出现空泡，有明显自溶现象，可见弥漫性坏死细胞，核明显大小不等，呈不同程度的固缩（见图1b）；富硒低剂量组（见图1c）与模型组比较，略有改观，但仍有大量炎症细胞浸润；富硒中剂量组（见图1d）中央静脉周围肝细胞坏死减少，有少量炎症细胞浸润；富硒高剂量组（见图1e）炎性细胞浸润少，肝细胞排列整齐，接近正常对照组和水飞蓟素组（见图1g）；而普通玉米肽组（见图1f）中央静脉周围仍有肝细胞坏死，部分细胞核出现空泡，可见大量炎症细胞浸润。

3 讨论

本试验结果表明富硒玉米肽能够显著抑制由CCl4诱导的小鼠血清中ALT活性、TG含量的升高和GSH含量的降低，同时亦可显著抑制肝组织匀浆中SOD活性、GSH－Px活性的降低和MDA含量的升高，且呈剂量－效应关系。其机制可能是由于富硒玉米肽能够直接清除自由基，例如羟基自由基［16］，从而抑制脂质过氧化反应。前期研究表明富硒玉米肽中富含Cys等含硫氨基酸［19］，巯基具有较强的自由基淬灭能力［20］，而通常硒能够取代硫的位置，生成硒代氨酸，亦具有一定的抗氧化能力；富硒玉米肽能增加SOD、GSH－Px等抗氧化酶的活性，从而加快自由基的清除，最终抑制MDA的生成，从而促进肝细胞的修复和再生。此外富硒玉米肽富含Leu、Ile等支链氨基酸，具有较高的F值，高F值寡肽具有治疗或缓解肝性脑病的症状，改善手术后及卧床病人的蛋白质营养状况等生理功能［21］，有报道高F值的蛋白质水解物，被用于临床治疗肝硬化［22］。本试验中，富硒玉米肽显著改善由于CCl4损伤造成的肝脏肿大，进一步证实了富硒玉米肽的良好作用。组织病理学切片也表明富硒玉米肽具有良好的保肝效果。

在蛋白含量相当的情况下，200mg／kg·bw的普通玉米肽与100mg／kg·bw的富硒玉米肽的保肝效果大致相当，说明微量元素硒在其中发挥了重要作用。相关研究显示富硒大麦苗、烟叶硒蛋白等也由于含有微量元素硒，与普通大麦苗、烟叶蛋白相比，表现出更好的保肝效果［8，23］，但其机制尚需进一步的研究。相同剂量的富硒玉米肽的保肝效果显著优于普通玉米肽，这可能与玉米蛋白水解物中的硒肽和含硒氨基酸的贡献有关，有报道含硒氨基酸能够直接或间接地发挥抗氧化作用［24］。此外硒也能清除CCl4在体内转化过程中形成的中间代谢产物及降低其毒害作用。如果组织中缺硒会造成细胞膜的损伤，因此硒的抗氧化作用可能抑制了肝细胞损伤［25－26］，从而起到了与玉米肽协同保肝作用。

4 结论

本研究表明富硒玉米肽对CCl4所致小鼠急性肝损伤有显著的保护作用，且与普通玉米肽相比，富硒玉米肽的有效保肝剂量显著降低。

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Hepatoprotective Effects of the Selenium－Enriched Corn Peptides Against Carbon Tetrachloride－Induced Liver Injury in Mice

Zhang Yan He Hui Zhang Jiuliang Wang Chi Hou Tao
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Key Laboratory of Environment Correlative Dietology Ministry of Education，Wuhan 430070）

The hepatoprotective effects of the selenium－enriched corn peptides have been evaluated to treat carbon tetrachloride（CCl4）－induced liver injury inmice.Seventy healthy Kunmingmalemicewere randomized into 7 groups for 10 mice／group as normal control group，CCl4－injured model group，low dose group，medium dose group and high dose group（100，200 and 400mg／kg·bw respectively），selenium－enriched corn peptides treatment group，corn peptides（200mg／kg·bw）treatment group and positive control group－silymarin（50mg／kg·bw）treatment group.The activity of alanine aminotransferase（ALT），the glutathione（GSH）level，the triglyceride（TG）level in serum，the activity of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSHPx），malondialdehyde（MDA）level and glutathione（GSH）level in liverwere determined aswell as the hepatic tissue index.Themorphology of hepatic tissue was also examined.The results showed that selenium－enriched corn peptides could significantly decrease ALT’PerillaLs activity，TG content level in serum，MDA level in liver（P＜0.01）and the liver enlargement.The selenium－enriched corn peptides could significantly increase GSH level，SOD activity，GSH－Px activity in liver（P＜0.01）in a dose－dependentmanner.The biochemical resultswere supple-mented by histopathological examination of liver section.The hepatoprotective effect of selenium－enriched corn peptides was significantly better than the normal corn peptideswith the same dose（P＜0.01）.When selenium－enriched corn peptides concentration reached to 400mg／kg·bw，its effectwas approximate to silymarin（50mg／kg·bw）.In conclusion，the study demonstrates that selenium－enriched corn peptides had a significant protective effect against CCl4－induced liver damage.The dose of selenium－enriched corn peptides with the potent hepatoprotective effect was significantly less than that of the normal corn peptides.

selenium－enriched corn peptides，CCl4－induced liver injurymodel，hepatoprotection

Q514

A

1003－0174（2015）

国家自然科学基金（30972043），863计划（2008AA10 Z314），中央高校基本科研业务费专项（2013PY095）

2013－12－02

张岩，女，1989年出生，硕士，食品化学

通迅作者：何慧，女，1960年出生，教授，博士生导师，食品化学03－0006－06