半夏无菌组织培养体系建立中存在的问题和解决方法

2015-12-18张利霞孟彦斌

安徽农业科学 2015年17期

关键词：珠芽原球茎外植体

张利霞，孟彦斌

(陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃陇南 742500)

半夏无菌组织培养体系建立中存在的问题和解决方法

张利霞，孟彦斌

(陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃陇南 742500)

分析了建立半夏组培体系过程中存在的污染、次生代谢产物毒害、低成活率、再生方式多样化的问题，提出了切实可行的解决方法，为对高效建立半夏组织培养体系的实践提供依据。

半夏；组织培养体系；建立；问题；解决方法

半夏组织培养技术主要用于大规模繁殖半夏优良品种和珍贵种质资源，茎尖脱毒和无毒苗扩繁以及人工半夏种子生产中，其首要环节是建立无菌组织培养体系。建立半夏无菌组织培养体系，就要解决污染、次生代谢产物毒害、成活率低、再生方式多样化的问题，笔者在此就这几种问题的发生情况及解决方法进行了分析。

1 污染及其预防措施

污染可导致组织培养体系建立工作失败，且引起污染的因素复杂多样，所以半夏组织培养无菌体系建立中最为关键和困难的问题是防止污染发生。

1.1 污染原因在组培半夏外植体建立中，引起污染的一类因素是外植体、消毒用容器、培养基、接种器械和接种室消毒不彻底，超净工作台过滤装置失效，操作人员未遵守操作规程等，使得培养材料外部或培养基上带有细菌、真菌等微生物，在培养最初的几天内培养材料和培养基上滋生菌丝或菌落，不及时处理会使所有材料和整个培养基表面均受到感染。引起污染的另一因素是外植体携带内生菌，培养初期并不表现污染，培养5 d后或更长时间才出现，污染程度较轻，但最难控制。在半夏外植体材料中，以块茎尤其是生长结束后采收的块茎引起的污染最为严重，珠芽的污染最轻。

1.2 污染的预防措施

1.2.1 接种环境严格消毒。接种室、培养室、超净工作台、消毒用容器、接种用器械、冲洗外植体材料所用的蒸馏水、工作人员的工作服和手都要严格消毒。笔者将冲洗外植体材料用的瓶装蒸馏水、消毒外植体用的容器也用牛皮纸包扎好，用高压锅消毒，减少了污染。

1.2.2 选择适宜的外植体及处理方法。在外植体材料的选择上尽可能采用生长旺盛时期健壮母株的珠芽和块茎，其带菌少，启动快，又较耐药剂消毒处理。生长结束后的块茎带菌多，可先无土栽培块茎，使其生长出珠芽，再以珠芽为外植体接种，能减轻污染。半夏外植体常规消毒方法是先用流水反复冲洗外植体，然后0.1%的升汞溶液处理材料10～15 min，用无菌水冲洗3次，再用70%～75%的酒精处理材料1 min，用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体水后切割接种。对带菌多消毒难的块茎先要用0.5%的吐温20浸块茎材料1 h，期间更换新鲜液2～3次，后用常规消毒方法灭菌，再剥去皮，用10%的次氯酸钠溶液消毒30 min。材料消毒和冲洗的过程中要不断搅拌材料，使药剂或水和材料充分接触。外植体材料消毒结束后，将其保留在消毒的容器中，瓶口对着酒精灯火焰的情况下对材料进行切割、接种。

1.2.3 分散培养。用试管分装培养基，灭菌后，每支试管中接一个材料进行培养，5～15 d内将无污染的材料转接在诱导培养基中，可避免多个材料接在一个培养瓶中造成的交叉感染和浪费。也可在每试管中接一粒消毒后的块茎或珠芽，培养一段时期后，剪取无污染材料的叶柄和叶片扦插组培。

1.2.4 应用农药或抗生素抑制病原菌。组培体系建立过程中任何环节操作不慎就带来污染，且外植体材料所带内生菌用前述的表面消毒方法难以杀灭，半夏块茎和叶也不耐多次消毒，为此可以参考其他植物组培的相关研究成果，用抗生素或农药预处理外植体，然后进行常规消毒，或将抗生素或次氯酸钠加入培养基中。彭广霖等用含5～10 mg/L次氯酸钠的培养基很好地抑制了组培中的枯草杆菌[1]。抗生素有利福平、氨苄西林钠、庆大霉素、链霉素等，在不同的植物组培上用量在5～1 000 mg/L不等[2-4]。这些都值得借鉴，但在半夏组织培养中需要先进行试验才能确定药剂类型和剂量，原则上要能抑制微生物，不对外植体造成较大毒害，不造成过高培养成本。

单一的抗生素抑菌也单一，且易使菌类形成抗药性，浓度高又影响植物生长，使用2种以上抗生素的效果较好。王志成等研究发现用60 mg/L米鲜胺和 300 mg/L氨苄青霉素或卡那霉素组合基本可抑制几种材料的污染混合物[5]。田永亮等在葡萄组培初期用2种抗生素有效抑制了污染菌，随后2种抗生素对污染菌均降低了抑制作用[6]，说明抗生素能抑制污染菌的生长，但不彻底杀灭污染菌，应用中要注意这一现象。

2 次生代谢产物毒害及预防

2.1 次生代谢产物及其毒害半夏的次生代谢产物有生物碱、β-谷甾醇、葡萄糖苷、半夏蛋白、脂肪酸[7]等，它们是半夏的生理活性成分，但在组培中对半夏生长和分化会起抑制作用。半夏中还含大黄酚[8]等酚类成分，在组织培养中可引起外植体褐化。笔者在半夏组培研究中发现，不加活性炭的MS培养基上半夏生长速度慢，愈伤组织小，分化的类原球茎少且小，组织容易老化；由于次生代谢产物的毒害使得土壤栽培半夏的轮作年限至少为5年。这是由于半夏在生长过程中不断向周围环境分泌次生代谢产物，环境中次生代谢产物的积累又反过来对半夏生长和发育起抑制作用。

2.2 次生代谢产物毒害的预防措施用比较年幼健壮的珠芽、叶、块茎作外植体，它们所含的次生代谢产物低，因而毒害小。以块茎作为接种的外植体时切割的伤口不宜大，否则代谢产物溢出多，毒害大。切块暴露在空气中的时间不宜长，在培养基中暴露的组织也不宜多，以减少酚类氧化而发生褐化的机会。用不含激素的1/2MS +3%葡萄糖培养基为初代培养基，接种后在较低温度和黑暗情况下进行初始培养[9]。培养基中加0.2%～0.3%的活性炭[10]，吸附次生代谢产物，预防次生代谢产物积累造成的毒害，且活性炭还能减轻外植体材料玻璃化，促进生根。对初代培养的材料及时转接，缩短转接周期，减少次生代谢产物的积累。

3 成活率和增殖率低及解决方法

3.1 成活率低的原因和表现由于外植体受污染、次生代谢产物毒害、消毒创伤等原因，在初代培养时成活率低，具体表现为叶片枯萎，叶柄两端水渍状坏死，块茎颜色变深组织变软后失去生命能力。成活的外植体也多表现出低增殖率、产生的愈伤组织或类原球茎少。

3.2 提高成活率的措施对外植体材料既要严格消毒以防带菌，还要防止消毒过度而造成死亡。用生长旺盛时期的珠芽作外植体材料最为理想，成活率最高。以块茎为外植体时在消毒后于1/2MS培养基中培养，几天后顶芽萌发，周围组织变绿，再进行切块和转接。块茎和珠芽的切块以顶端生长点为中心，辐射状纵切，尽可能使每个材料均带顶端组织，接种后成活率和增值倍数高，生长速度快。消毒后的叶柄去掉两端损伤的部分，叶片剪掉边缘然后接入培养基中容易成活和诱导。

4 再生方式多样化及解决途径

4.1 半夏再生方式组培中半夏再生方式多样化，一种是一步成苗，即从外植体上直接长出叶和根，形成完整的植株。用带顶芽的块茎和珠芽切块作外植体多是这种再生方式。刘彩莲试验得出块茎是诱导半夏一步成苗的最优外植体，且最佳培养基及激素配比组合为MS+0.2 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L KT+0.1 mg/L NAA[11]。另一种再生方式是从半夏外植体材料上直接产生不定芽或类原球茎。这种方式基本不通过愈伤组织渠道，所以速度快、用时短、遗传稳定，但增殖率低，以叶柄、叶片诱导容易形成类原球茎。李先良等以叶片在MS+ 0.5 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA培养基上诱导形成珠芽，但每个外植体仅能形成3.5个珠芽(类原球茎)[12]。第3种增值方式是外植体在创伤和激素诱导下先脱分化产生愈伤组织，愈伤组织上产生不定芽或类原球茎。由于愈伤组织细胞的分生能力强，故能分化出大量不定芽或类原球茎，极大地提高半夏繁殖系数，但遗传稳定性不能保证。陶米林等分析发现半夏顶芽愈伤组织诱导最佳培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L[13]。

4.2 半夏再生方式的利用 3种再生方式各有优缺点，建立组培体系工作中要根据现有的材料、培养目的、外源激素的效应等因素合理规避或加以利用。具体方法为：①一步成苗适用于筛选无菌苗，即将块茎或珠芽用小容器分散培养成苗，选择无菌苗，以其叶片、叶柄、珠芽为外植体重新进行诱导产生愈伤组织、类原球茎或不定芽。②从外植体材料上直接产生的类原球茎颜色深、结构致密，容易发芽长成完整植株，可直接以类原球茎作为种子。因其增殖倍数小，所以在组培上要加大接种量以提高群体的产量。③通过愈伤组织的途径产生的不定芽只能作为继代培养的外植体，产生的类原球茎既可作为继代培养的外植体，也可作为种子，因此通过选用适宜的外植体材料和激素组合的培养基引导愈伤组织朝需要的方向生长。愈伤组织太大浪费养分多，其上生长的不定芽或类原球茎体积小，所以也要控制激素含量以控制愈伤组织大小。④愈伤组织的细胞比其他的细胞容易发生变异，其中可能有染色体多倍性变异。多倍体一般比二倍体的个大，或内含物多，表现为倍性效应，多倍体半夏也容易通过无性繁殖固定下来，因此工作人员应该经常观察，选择优良变异，将其培育成优良品种。⑤同一外植体材料在同一种培养基中不一定只表现一种增殖方式，对管理和利用带来一定的不便。要尽可能用同一种材料，选用最适宜的培养基，使半夏组织的生长步调相同。

5 结论

半夏组织培养体系的建立以防止污染和褐化、提高成活率为中心任务，通过选择适宜的外植体材料和消毒方法，改进接种技术，改善培养条件，引导半夏组织再生方式，经济高效地建立无菌体系。半夏块茎、珠芽、叶片、叶柄均可作为外植体，以旺盛生长时期的地上珠芽带毒少，又耐消毒，成活率高，增值率高，是最为理想外植体。对接种环境严格消毒，对外植体适度、多重消毒，分散培养，既要消除污染，又要保证一定的成活率。用低浓度MS培养基，并添加活性炭，分步进行初始培养和诱导培养，缩短转接时间，以减轻褐化。通过选择外植体和外源激素，引导半夏再生方式朝需要的方向发展。

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