槲皮素在分子印迹聚合物修饰碳糊电极上的电化学行为及测定

张旭红，周 清，翟海云，潘育方

（1.广东药学院中药学院，广东 广州 510006；2.广东药学院药科学院，广东 广州 510006）

0 引 言

槲皮素（Quercetin）广泛存在于植物中，具有抗氧化及清除自由基、保护心血管系统以及抗病毒等药理活性[1-3]。关于槲皮素含量的测定方法已有较多相关报道，主要有紫外分光光度法，反相高效液相色谱法等，也有相关文献采用电化学方法进行含量测定。现将相关测试方法的一些特点在表1中列出。

本实验采用操作成本低，选择性、灵敏度均较高的分子印迹聚合物修饰碳糊电极法测定药物中的槲皮素含量。单纯的碳糊电极（CPE）作用有限，但可以通过电极修饰的方法使碳糊电极具有一定的功能，即化学修饰碳糊电极。而分子印迹聚合物（MIP），具有较好的通用性和立体专一识别性，已广泛应用于色谱分离、生物传感器以及酶的模拟和催化合成等领域[8-9]。本实验以经过分子印迹聚合物修饰的碳糊电极（MIP-CPE）作为工作电极，测定槲皮素的电化学行为，并且应用于胶囊中槲皮素含量测定。结果显示该方法稳定可靠，检出限低，检测方便，易于推广。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Ingsens-1000系列掌上型电化学工作站（盈思仪器（广州）有限公司）；分子印迹聚合物修饰碳糊电极（自制）为工作电极；Ag-AgCl（饱和KCl）电极为参比电极、铂电极为对电极（上海辰华仪器有限公司）；pHS-25型酸度计（上海雷磁新泾仪器有限公司）。

槲皮素（中国药品生物制品检定所），槲皮素维生素C复合胶囊（普瑞登健康食品公司），甲基丙烯酸（MAA，AR，成都市科龙化学试剂厂），乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA，AR，阿拉丁试剂有限公司），偶氮二异丁腈（AIBN，AR，天津市科密欧化学试剂有限公司），石墨粉（GR，国药集团化学试剂有限公司），液体石蜡（AR，成都市科龙化学试剂厂）。其余试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

1.2 分子印迹聚合物的制备

称取0.3022g槲皮素溶于100mL甲醇中，印迹分子、MAA、EGDMA 的比例采用经典的摩尔比 1∶4∶20，按比例加入功能单体（MAA）0.34mL、交联剂（EGDMA）3.77mL，最后加入引发剂（AIBN）0.09g充分混匀后，向混合液中通氮气10min，蜡封后置于恒温水浴箱，60℃聚合24h。聚合产物取出冷却至室温，用醋酸-甲醇（V∶V=1∶9）溶液淋洗至洗脱液中检测不到槲皮素分子，再用甲醇洗去过量的醋酸，于烘箱中40℃干燥即得槲皮素分子印迹聚合物。

1.3 修饰碳糊电极制作和活化

石墨粉和印迹聚合物质量比为4∶1，按照m（石墨+聚合物）∶m（石蜡）=4∶1[10]混合均匀后，装入半径为2.0mm的玻璃管中压紧，用铜丝线做导线，引出后固定电极，将电极表面在平滑的白纸上磨平抛光，备用。在pH 3.6的HAc-NaAc缓冲液中以100 mV/s的扫速于0～0.6V循环扫描20次，以活化电极表面。

非分子印迹聚合物修饰碳糊电极（NIP-CPE）的制作除了不加槲皮素模板因子以外，其余与MIP-CPE制作步骤相同。

1.4 槲皮素标准溶液配制

0.001 mol/L槲皮素标准溶液的配制：准确称取0.0302g槲皮素用少量的乙醇溶解后用乙醇定容于100mL容量瓶中，然后置于冰箱内冷藏，待使用时用蒸馏水稀释至所需浓度。

1.5 样品前处理

称量并计算平均每粒槲皮素维生素C复合胶囊（Puritian’s Pride Inc，标示量为 250mg/粒）的质量。为防止维生素C对检测结果的干扰，取4粒胶囊，倾取内容物溶于200 mL的去离子水中，过滤，取滤渣干燥，并称取滤渣1/2的质量，约含槲皮素125 mg，装在50 mL锥形瓶中，加甲醇约20 mL，超声30 min后，转移至50 mL容量瓶中，甲醇定容，微孔滤膜过滤，取续滤液1 mL于25 mL容量瓶中，并用甲醇定容，备用。

表1 槲皮素含量测定方法特点

1.6 电化学测试

取1.4、1.5项下的溶液适量，用pH 3.6的HAc-NaAc缓冲溶液稀释至刻度，摇匀即为样品溶液。将样品溶液移入小烧杯中，插入三电极系统，扫速100 mV/s从0 V扫描至0.6 V，富集150 s，记录其在0.34V附近的峰电流。

2 结果与讨论

2.1 槲皮素分子印迹效应

在物质量浓度为1.0×10-4mol/L槲皮素溶液中，以100mV/s的扫速在0～0.6V间扫描。结果如图1所示，分子印迹聚合物修饰碳糊电极有良好的响应效果，而非分子印迹聚合物修饰碳糊电极与裸碳糊电极对槲皮素响应均较小。图1中a是槲皮素在MIP-CPE上的连续扫描循环伏安曲线，阳极扫描有峰，其峰电位在0.338V，而反向扫描过程中，亦有观察到相应的还原峰，其峰电位为0.276V，说明槲皮素在MIP-CPE上的氧化是可逆的。

可能是由于槲皮素印迹聚合物具有分子印迹效应，槲皮素分子可通过印迹孔穴扩散至分子印迹聚合物修饰碳糊电极表面，发生电化学氧化反应，与印迹识别位点之间的亲和性增加。该结果表明槲皮素分子印迹聚合物对槲皮素模板分子识别吸附能力增强。

图1 槲皮素的分子印迹效应

2.2 测试条件的确定

2.2.1 聚合物修饰碳糊电极的组成

碳糊电极中，石墨-液体石蜡比例为4∶1时电极的效果最好，峰电流最大，峰型相对好。因此，在制备分子印迹聚合物修饰碳糊电极时，以m（石墨+聚合物）∶m（石蜡）=4∶1制作工作电极，比较石墨粉与分子印迹聚合物不同质量比（90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，55∶45）对扫描结果的影响。活化后，分别在5.0×10-5mol/L槲皮素溶液中，以100mV/s的扫速从0V扫描至0.6V，扫描结果见图2，当石墨粉与分子印迹聚合物的比例为80∶20时，有较强的信号及较好的峰形，对槲皮素的识别能力明显增强。故本次实验以m（石墨+聚合物）∶m（石蜡）=4∶1，其中石墨粉与分子印迹聚合物的比例为80∶20，制作实验的工作电极。

图2 分子印迹聚合物修饰碳糊电极组成对峰电流的影响

2.2.2 缓冲溶液的选择

在 NaH2PO4-NaOH、Na2SO4-NaOH、B.R、H3PO4、HAc-NaAc、HNO3、H2SO4、HCl等缓冲溶液中分别进行试验。结果发现在强碱和中性溶液中氧化峰均不明显，在弱酸中氧化峰较好。在HAc-NaAc缓冲溶液中波形最好，峰电流最大，稳定性好，故选择HAc-NaAc缓冲溶液为底液。

2.2.3 pH值对峰电流的影响

当槲皮素物质量浓度为1.0×10-4mol/L时，研究峰电流随pH值的变化规律，结果如图3所示，峰电流随着pH值增大呈现先增大后减小再增大的变化规律，但增大后的响应值不如较低pH值时的峰电流值大。由图可知，在pH 3.6附近的峰电流相对较大且稳定，峰形较好，故选择pH 3.6的HAc-NaAc溶液为底液。

2.2.4 搅拌富集时间对峰电流的影响

图4是在2个不同槲皮素浓度下测定搅拌富集时间对峰电流的影响。当物质量浓度为1.0×10-4mol/L时，峰电流在110s出现最大值；物质量浓度为1.0×10-5mol/L时，峰电流在150s出现最大值。由图可知，峰电流随搅拌富集时间增加先增大后减小。浓度不同的槲皮素峰电流值达到最大值所需要的时间不同。浓度越小，达到最大值所需要的时间越长；浓度越大，达到最大值所需要的时间越短。为了使不同浓度下富集时间更合理，实验时选择150s的富集时间。

图3 pH值对峰电流的影响

图4 搅拌富集时间对峰电流的影响

2.2.5 扫描速率ν对峰电流的影响

用循环扫描伏安法研究了扫描速率ν对峰电流的影响，结果发现槲皮素的氧化峰电流与扫描速率在10～400mV/s之间呈现出一定的线性关系，如图5所示，线性方程为 y=0.0049x-0.0241（r=0.992），x 为扫描速率（mV/s），y为峰电流（μA）。实验发现峰电流随着扫描速率增大而增大，峰电位向高电位方向移动，但峰型会随着扫描速率增大而变差。为了获得较好的峰型，实验中扫描速率选择为100mV/s。不同扫描速率下，峰形的变化情况如图6所示。

图5 扫描速率与峰电流的线性关系

2.3 线性范围与检出限

图6 不同扫描速率对峰形的影响

图7 槲皮素浓度与峰电流的线性关系

图8 标准曲线的循环伏安图

在最佳实验条件下，槲皮素在1.25×10-6～4.0×10-5mol/L范围内与峰电流呈良好线性关系（见图7），回归方程为：y=0.0918x+0.6408，r=0.9950，浓度梯度分别为 1.25×10-6，2.5×10-6，5.0×10-6，1.0×10-5，2.0×10-5，4.0×10-5mol/L）。槲皮素不同浓度标准溶液在MIPCPE上的循环伏安图如图8所示，随着槲皮素标准溶液浓度增大，响应值峰电流依次增大。

固定槲皮素物质量浓度在5.0×10-6mol/L，测定响应峰电流（n=12），计算检出限为 4.72×10-8mol/L。结果显示，槲皮素分子印迹聚合物修饰碳糊电极线性范围较宽，且具有较高的灵敏度。

2.4 样品分析

分子印迹聚合物修饰碳糊电极测定槲皮素维生素C复合胶囊中槲皮素含量，按1.5.项下方法处理样品，最终测得复合胶囊中槲皮素平均含量为每粒251.8mg（n=3，RSD=3.0%）。实验表明经处理后胶囊中的共存物对测定的干扰较少。回收率测定结果见表2。

表2 胶囊中槲皮素含量的测定结果及回收率（n=3）

3 结束语

分子印迹聚合物特异性识别能力较高，能明显增强槲皮素在电极上的响应信号及其抗干扰的能力。与紫外分光光度法、高效液相色谱法以及其他相关电化学方法相比，分子印迹聚合物修饰碳糊电极法具有选择性高、检出限低、分析时间较短、分析仪器体积小巧、安全性相对较高、易于推广等优势。

本文研究了槲皮素在分子印迹聚合物修饰碳糊电极上的伏安行为，建立了利用该修饰电极测定槲皮素的电化学分析方法，并测定了槲皮素维生素C复合胶囊中的槲皮素含量，结果满意。修饰电极是自制的，廉价、无毒，制作过程方便简单，电极表面容易更新而且灵敏度相对较高；电极的表面积小，对样品的消耗量少，实验操作方便，所测样品处理要求简单，易于推广到药理和临床医学的研究。

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