双水相萃取技术在提取纯化生物制品中的应用*

范勇，卢艳敏，崔波

(齐鲁工业大学食品科学与工程学院，山东 济南，250353)

双水相(aqueous two phase systems，ATPS)即2种不相溶的聚合物溶液或聚合物溶液与盐相互混合达到一定临界浓度时，形成互不相溶的两相。双水相系统主要有以下几种类型:聚合物-聚合物，聚合物-盐，离子液体-盐，小分子醇-盐和2种表面活性剂［1］。1956年，Albertsson等测定了多种双水相的相图及研究多种生物制品(如蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒)在双水相中的分配行为。其研究表明，ATPS法提取生物制品蕴含巨大的应用价值［2］。ATPS技术主要优势:ATPS含水量达70%～90%，能提供温和的提取条件和环境，适于提取不稳定的生物粒子;界面张力低，可提高传质速度;ATPS技术可连续化，集成化生产，减少单元操作过程。此外，ATPS技术优势还包括自然分相时间短，易于扩大化生产，分配系数可控。ATPS已被广泛应用于多种生物制品的提取纯化［3-4］。

1 双水相法提取生物制品

ATPS提取生物制品可归纳为以下几个方面:(1)提取蛋白质、酶，ATPS提取蛋白质的优势在于大大降低了破坏蛋白质结构的可能性，保留其原有的活性;(2)提取遗传物质DNA;(3)提取具有高附加值的小分子物质;(4)提取细胞及细胞器。物质的表面性质、电荷作用、与疏水键的相互作用使目标物与杂质在上下相分配系数不同，可将目标物与杂质分离，如通过物质的表面性质(疏水性、亲水性)将目标物与杂质(表面性质与目标物相反)分离。目前研究较多的是ATPS萃取目标物的实验工艺条件，影响目标物分配行为包括多种因素，如ATPS体系的组成成分及分子质量、浓度或TLL，pH值，相比Vr，温度，样品添加量等，评价指标包括提取率、分配系数K、纯化因子等参数，综合考虑以上影响因素及评价指标可利用多种方法达到最佳提取条件。

1.1 双水相法提取蛋白质

ATPS提取的蛋白质主要有酶、具有治疗作用的抗体、捕光色蛋白质如藻胆蛋白等。ATPS提取蛋白质的优势在于大大降低了破坏蛋白质结构的可能性，保留其原有的活性。关于ATPS提取分离蛋白质的研究应用已有诸多报导。

Radosław Dembczyn'ski等［5］用环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EO50PO50)-K2HPO4体系从蛋清中提取溶菌酶，实验采用了3种不同浓度的体系，综合考虑分配系数和提取率，采用体系B(3.3%EO50PO50，13.3%K2HPO4，pH=7，0.85 mol/L NaCl，样品添加量为稀释3倍的7 mL蛋白)。由于EO50PO50的浊点较低，将富含EO50PO50的上相提取出来再经过加热(高于其浊点)使其形成两相，溶菌酶分配在富含水的上相，实验表明经过2次ATPS提取后提取率、纯化因子和酶活分别为85%，16.9，32，300 U/mg。应用温度诱导分离型聚合物的ATPS提取溶菌酶有利于相成分的循环再利用，可降低生产成本。Aguilar等［6］用聚乙二醇(PEG)-磷酸钾盐ATPS提取由大肠杆菌重组菌生产的青霉素酰化酶，实验表明最优参数为PEG 1 450 g/mol，系线 TLL 48.5%，相比 Vr=1.0，pH=7，样品添加量35%时，上相纯化因子和提取率达分别为3，97%。此外，将ATPS法与色谱法提取青霉素酰化酶的实验成本进行比较，ATPS法的花费减少了37%。成本降低是由于操作单元的减少。因此证明ATPS法适于提取青霉素酰化酶及具有规模化生产的前景。

关于ATPS法提取具有治疗作用的蛋白质已有广泛研究报导。Platis等［7］研究采用PEG-磷酸钾盐ATPS提取在转基因烟草中表达的HIV单克隆抗体2F5(mAb2F5)，在最优条件下PEG 1 500 g/mol 12%，K3PO413%，pH=5，提取率和纯化因子分别为95%，3～4。Rosa等［8］用含有化学改性 PEG 的ATPS提取由中国仓鼠卵巢细胞生产的人体免疫球蛋白gamma(IgG)，在血清中，IgG是含量最多的免疫球蛋白，其具有重要的免疫作用。实验表明，用含有150 g/mol PEG-COOH的PEG-葡聚糖(简写Dex)体系提取IgG，IgG的纯化因子和提取率分别为1.9，93%。ATPS中添加化学物质如修饰的聚合物、金属离子、极性溶剂等可提高目标物的选择性，提高目标物的产率和纯度。目前，国内外已开展了应用亲和双水相(聚合物上耦联特定的亲和配基)提取蛋白质的研究，表1为近年来应用亲和双水相提取蛋白质的实例。

表1 亲和双水相法提取蛋白质的实例Table 1 some examples of aqueous two-phase affinity partitioning systems for recovery and purification of proteins

由于人们越来越重视合成色素对人体健康的危害，所以在食品和化妆品行业中关于提取纯化有色化合物的研究越来越多。某些天然有色化合物在分子技术领域中可以作为荧光标记。存在于藻类和蓝细菌中的藻胆蛋白是一种重要的捕光色蛋白，这种蛋白可作为天然色素使用。Benavides［17］等用 PEG-磷酸钾体系从紫球藻中提取纯化B-藻红蛋白(BPE)，实验表明，最优条件为PEG1000 g/mol(29%)-磷酸钾盐(9%)，TLL 45%，Vr=4.5，pH=7，提取率和纯化因子分别达 90%，4。Chethana等［18］用 PEG-磷酸钾盐从钝顶螺旋藻中提取C-藻蓝蛋白(CPC)，C-藻蓝蛋白富集在PEG上相，实验研究了PEG分子质量、系线TLL、体积比Vr、PEG浓度、盐浓度对CPC分配行为的影响。PEG 1500分配系数K随TLL的增加而增加，但纯度降低，PEG 4000，6000 ATPS中的CPC的分配行为与体系PEG 1500相似。同样考查了3种不同Vr(0.22，0.54，1.25)对CPC分配行为影响，Vr=0.22，CPC纯化因子最大达3.4，但提取率仅为40%(PEG 4000/磷酸盐TLL14%)。实验条件在pH 7.0，PEG4000 6%，磷酸盐 15%，Vr 0.25，纯化因子和提取率达4.32，79%，实验结果表明此ATPS适于提取钝顶螺旋藻中的CPC。

1.2 双水相法提取遗传物质

关于ATPS法提取纯化遗传物质的研究已有报道，如质粒 DNA 载体。Trindade 等［19］用 PEG-(NH4)2SO4体系提取质粒DNA(pDNA)载体。实验从大肠杆菌细胞溶解产物中提取质粒DNA载体，体系条件为PEG 600 34%，(NH4)2SO46%，Vr=9.3样品添加量20%，pDNA完全分配在下相，提取率达100%，pDNA浓缩了3倍。为了实现工艺过程强化，样品添加量从20%提高到40%，样品添加量40%为时，提取率达为85%，pDNA浓缩了8倍。

Duarte等［20］用ATPS法提取pDNA与聚合物相连的一种复合物，此种复合物是一种可用于基因治疗的基因载体。采用2种ATPS体系(600 g/mol PEG-(NH4)2SO4和350 g/mol PEG-Dextran 110)连续进行提取，将聚乙二醇化聚乙烯亚胺(pPEI)添加到第二阶段的ATPS体系中，pPEI作为亲和配体可与目标物定向结合，可提高双水相对目标物的选择性。经过2种ATPS萃取后RNA和杂蛋白被完全分离去除，目标复合物的提取率达到100%，虽然用超滤膜将目标物与PEG和Dextran分离时会使目标物产率损失5%～10%。但实验证明了亲和双水相对于质粒复合物的提取具有潜在的应用价值。

Matos等［21］用2次ATPS从PCR中提取小片段DNA，首先用PEG4000-聚丙烯酸盐24000ATPS提取DNA，PCR分配在富含 PEG的上相，再将上相与Na2SO4组成双水相，DNA分配在富含Na2SO4的下相，蛋白质和大分子DNA被除去，小片段DNA(小于4000 bp)的提取率达95%。

1.3 双水相法提取小分子物质

近年来，具有高附加值的小分子物质成为研究热点，应用ATPS法提取小分子物质的研究也逐渐增加。Zhi jian Tan等［22］用ATPS法从芦荟中提取具有抗氧化作用和药用价值的蒽醌类化合物(AQs)，实验考查了不同小分子醇与(NH4)2SO4组成的双水相提取AQs，结果表明采用正丙醇-(NH4)2SO4体系提取率最高，条件为 25℃下，正丙醇 17.84%，(NH4)2SO426.66%，AQs的最高提取率达95.56%。

Peretra 等［23］用PEG-聚丙烯酸钠(NaPA)-Na2SO4提取克拉维酸，实验首先考查聚合物PEG(2000，4000，6000)和聚丙烯酸钠对克拉维酸的影响，结果表明2种聚合物对其没有降解。研究NaCl和Na2SO4对克拉维酸分配系数 K的影响，添加Na2SO4体系的K值高于添加NaCl的，与NaCl相比Na2SO4对克拉维酸分配在富含PEG上相的作用更强。体系条件为 PEG4000 10%，NaPA8000 20%，Na2SO46%，K值为9.15。此体系中克拉维酸的K值高于PEG-磷酸钾ATPS(K=8.2)，证明这种ATPS体系适合克拉维酸的初步纯化。

孙晨等［24］采用脂肪醇聚氧乙烯醚(AEO-7)-NNa3PO4·12H2O双水相提取L-苯丙氨酸，实验考察了不同盐(NaCl、Na2SO4、NNa3PO4)、AEO-7 含量、提取时间、加入L-苯丙氨酸的含量和温度对L-苯丙氨酸提取率和分配系数的影响，当条件为AEO-7的体积浓度为8%，NNa3PO4·12H2O的质量浓度为85 g/L，温度40℃，L-苯丙氨酸的质量浓度为0.532 8 g/L，提取时间60 min，L-苯丙氨酸的提取率和分配系数分别为98.7%，15.3，实验表明AEO-7 /NNa3PO4ATPS适于提取L-苯丙氨酸

1.4 双水相法提取细胞及细胞器

ATPS法提取细胞，主要应用包括细胞分选、细胞器的分离。熊霞等［25］采用ATPS纯化大鼠背根神经节细胞质膜，差速离心后得到的质膜浓度提高了2.3倍。Edahiro［26］采用PEG-Dex提取花青素含量较高的草莓细胞，花青素含量差异大的细胞被分开，分成2个细胞群。ATPS中添加1.8 mmol/kg磷酸钾缓冲液，培养10 d花青素含量高的草莓细胞完全分配在下相。Morre等［27］采用ATPS法从哺乳动物细胞中提取质膜和高尔基体，质膜纯度达85%，离心后下相高尔基体浓缩了3.5倍。与上相的亲和力由小到大依次为内质网、线粒体、高尔基体、溶菌酶和核内体、质膜。ATPS法适于提取细胞及细胞器。

2 双水相与其他其他新技术的集成

为更高效的提取分离目标物，采用ATPS与其他新技术集成。主要包括:(1)与双向电泳技术结合，主要应用与蛋白质提取方面以得到相关信息;(2)与微流控制技术相结合，通过流体动力学提高传质速率来提高提取分离效果;(3)与高速逆流色谱技术结合，有效的将ATPS萃取技术与色谱分离结合在一起，高效的提取纯化目标物质;(4)双水相与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术等常规技术实现集成化，改善了双水相萃取技术中的一些问题，如成相聚合物回收困难、相分离时间较长、易乳化等。

2.1 双水相与双向电泳技术结合

ATPS与双向电泳(2-DE)技术结合主要应用与蛋白质提取方面，通过双向电泳图谱得到蛋白质的一些相关信息如分子质量、等电点(pI)、表达水平。双向电泳具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点，克服了SDS-PAGE的一些不足，如SDS-PAGE很难检测到低丰度蛋白，聚合蛋白质，疏水蛋白。Gu和Glatz［28］将双水相PEG3350(15.7%)Na2SO4(8.9%)-NaCl(3%)与双向电泳结合得到蛋白质特性的3D图，包括等电点pI、分子质量MW和表面疏水性SH。得到玉米胚芽蛋白的3D图，与pH=7的玉米胚芽提取物相比，pH=4时提取物蛋白质较少、疏水性强、分子量小。

2.2 微流控制与双水相技术结合

微流控制分离通过改变几何形状来影响两相间的流动模式和界面形状，从而提高界面间的传质速率和目标物的提取率。近年来，微流控制技术与ATPS结合的研究已受到关注。黄宇石等［29］用 PEG-(NH4)2SO4体系提取糖化酶，实验设计了提取分离的微流控装置，研究了微通道内的雷诺层流条件，并将了微流控和烧杯中的ATPS(PEG24%，(NH4)2SO420%，Vr=1，糖化酶酶粉0.03g)溶液进行了对比实验，微流控萃取的传质速率是烧杯中的2.8倍，微通道和烧杯中单位双水相体积单位时间的传质量分别为127.15，2.96 g/cm3·s，前者是后者的 42 倍，微流控制与ATPS技术相结合，提供了两相较快的环隙流动速度和较大的传质比表面积，微流控双水相萃取效果远优于普通烧杯中萃取。

SooHoo［30］将 ATPSPEG-葡聚糖(简写 Dex)与微流控制结合从全血中提取白血球，实验根据微流装置的层流流动特点，考查聚合物间无稳定界面(不相融的PEG-PEG-Dex)，一个稳定界面(不相融的 Dex-PEG-Dex)，2个稳定界面(PEG-PBS(磷酸盐缓冲液)-Dex)3种萃取情况，结果表明提取效果最好的配置是Dex-PEG-Dex，其白细胞与红细胞之比是样品的9.13倍。

Meagher等［31］应用微流控制双水相法，结果表明可除去约85%的杂蛋白。Yushi Huang［32］等用微流控制双水相法提取牛血清蛋白，3个周期提取仅用3.6s，牛血清蛋白提取率达71%，结果优于普通双水相。

2.3 高速逆流色谱与双水相结合

郅文波等［33］采用高速逆流色谱与 PEG1000-磷酸钾盐ATPS相结合对标准蛋白质混合物以及卵白蛋白进行分离，结果表明 PEG1000 15%，K3PO4盐17%，pH 9.2，高速逆流色谱流速0.8 mL/min，转速850 r/min，成功分离细胞色素C、溶菌酶和肌红蛋白的混合物，PEG1000 16%，K3PO417%，pH 9.2，高速逆流色谱流速1.8 mL/min，转速850 r/min，200 min内从鸡蛋蛋清样品中分离卵白蛋白，其电泳纯度为100%，收率达95%。

Liu等［34］将高速逆流色谱与 ATPS乙醇-(NH4)2SO4相结合成功分离4种核苷，双水相条件为乙醇27%，(NH4)2SO421%，高速逆流色谱以上相作为流动相，流动方向从头到尾，流速0.7 mL/min，转速800 r/min，分离了4种核苷腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶核苷。

2.4 双水相与其他技术相结合

Lopes等［35］采用温度诱导双水相体系从大肠杆菌发酵液中提取绿色荧光蛋白和除去内毒素，结果表明，绿色荧光蛋白的提取率达96%且除去了99%的内毒素。翟素玲等［36］采用双水相电泳(PEG-Dex)分离氨基酸，结果表明，ATPS萃取过程中外加电场使苯丙氨酸和色氨酸的分离效果有明显的提高，延长分离时间或提高电场强度使苯丙氨酸萃取率达到90%以上，基本实现完全分离。Save等［37］将ATPS萃取与气溶胶技术结合，实验考察了淀粉转葡糖苷酶的传质性能，传质系数 K高于喷射床，表明ATPS萃取结合气溶胶技术有效提高了萃取柱的传质性能。

3 双水相技术面临的问题及展望

ATPS萃取技术克服了有机溶剂使生物粒子变性作用，其操作条件温和适于提取生物制品。对于蛋白质、遗传物质、小分子物质、细胞、细胞器的提取分离已有许多的研究，但双水相萃取技术还面临很多问题:(1)对于ATPS机理研究还不够成熟，需进一步的深入研究。ATPS组分间作用比较复杂，目标物的分配行为受表面性质、电荷作用与其他作用力的影响。关于物质在ATPS体系间的分配行为的研究比较少，缺乏理论或模型解释;(2)ATPS萃取生物制品虽具有粗分离的作用，但同时也引入成相物质且目标物与成相物质难于分离，对后续分离工艺不利，分离过程产生的成相物质的溶液难于回收利用;(3)ATPS萃取的研究多数建立在实验基础上，缺乏对于相际间传质传递的动力学研究。所以作为一种重要的提取纯化的技术方法ATPS萃取应用于工业生产还面临诸多问题。

目前，在生物制药业中，下游加工过程的费用占总成本的40%～70%，因此，关于降低ATPS生产成本的研究也不断增加。降低ATPS生产成本的方法主要有:(1)降低ATPS组成成分的成本，开发廉价ATPS体系;(2)ATPS相成分循环再利用。Ghosh等［38］用廉价的 DexT40代替昂贵的 DexT50，用变性淀粉、乙基羟乙基纤维素等代替昂贵的葡聚糖，用羟基纤维素、聚乙烯醇等代替PEG，可制成廉价的ATPS体系。Dembczyński等［39］用 EO50PO50-K2HPO4温度诱导 ATPS体系提取溶菌酶，研究了相成分EO50PO50和K2HPO4的循环再利用提取溶菌酶。但ATPS萃取生物制品仍有巨大潜在的价值，研究人员也在不断探索以解决以上所面临的问题。

ATPS萃取技术未来发展的方向主要包括2个方面:(1)所有理论研究不能脱离实际应用，ATPS萃取技术的发展应适于大规模的工厂生产，要相对容易建立投产这就离不开技术集成化和提高ATPS萃取技术本身的优势，在萃取的同时达到分离以节省后续分离的麻烦，使其在应用中可减少成本的投入;(2)同时生产应用离不开理论基础研究，ATPS萃取技术所面临的问题正是理论研究亟待解决的，ATPS体系热力学和动力学机理研究的不断深入也是此技术未来发展的一大挑战。

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