质粒抽提策略对双酶切鉴定的影响

金科华，刘 洁(湖北科技学院基础医学院生物化学教研室，咸宁 43700;湖北科技学院护理学院;通讯作者，E-mail:3643986@qq.com)

双酶切联合琼脂糖凝胶电泳是鉴定DNA重组成功与否的重要方法［1］，琼脂糖凝胶电泳图像质量直接影响鉴定结果的判读、论文发表。条带弥散是图像质量不佳的主要表现之一，研究者多将其归咎于不合理的酶切和不规范的电泳操作［2］，而很少报道质粒抽提策略对弥散的影响。笔者在双酶切鉴定葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose 6-phosphate dehydrogenase，G6PD)重组质粒pET-28a-G6PD时，发现质粒抽提策略对双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显著影响，现报道如下，以供参考。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

含空质粒 pET-28a的大肠杆菌 Top10(pET-28a/Top10)由本教研室保存。重组质粒pET-28a-G6PD为笔者构建并转化至Top10感受态细胞中。

1.2 试剂与仪器

质粒小量提取试剂盒、卡那霉素、50×TAE电泳缓冲液购自上海生工生物工程有限公司，快速限制性核酸内切酶为Fermentas公司产品，琼脂糖为Biowest公司产品。酵母浸出粉、胰蛋白胨为OXIOD公司产品。MilliQ超纯水为实验室自制。DNA marker为TAKARA公司产品。POWER Pac HC高电流电源为BIO-RAD公司产品、GIS凝胶成像仪为上海天能公司产品，DYCP-31DN型电泳槽为北京六一仪器厂产品。

1.3 菌液培养

将含 pET-28a和 pET-28a-G6PD的大肠杆菌Top10分别划线于含100 μg/ml卡那霉素的LB平板中，37℃倒置培养15 h。挑单菌落各1个，接种至40 ml(装于250 ml三角瓶中)含50 μg/ml卡那霉素的LB中，于摇床内37℃ 250 r/min培养，用上述不含菌液的LB作为空白对照，用可见分光光度计测定600 nm处的菌液的光密度值(OD600)，至OD600为 1.6，停止培养。

1.4 取1.4 ml菌液抽提质粒

利用质粒小量提取试剂盒抽提质粒。步骤如下:①分别从各瓶吸取菌液1.4 ml至1.5 ml管心管，室温10 000 r/min，离心30 s，弃上清;②加250 μl溶液 P1，3 000 r/min 涡旋 1 min;③加 250 μl溶液P2，温和颠倒混匀10次，室温静置4 min;④加入350 μl溶液P3，温和颠倒混匀10次;⑤室温12 000 r/min 离心6 min;⑥取750 μl上清于另一1.5 ml离心管，室温14 000 r/min 离心10 min;⑦取600 μl上清于吸附柱中，室温9 000 r/min离心30 s;⑧弃滤液，向吸附柱中加500 μl WD1，室温10 000 r/min离心1 min;⑨弃滤液，向吸附柱中加500 μl wash buffer，室温 10 000 r/min 离心 1 min;⑩重复⑨一次;○11弃滤液，将吸附柱置于收集管中，室温13 000 r/min离心2 min;○12将去盖的吸附柱置于灭菌的1.5 ml离心管，做好标记，向吸附柱中加入80 μl灭菌超纯水，室温静置2 min，13 000 r/min离心1 min，收集滤液，冰浴备用。

1.5 取2×0.7 ml菌液抽提质粒

分别从各瓶取菌液0.7 ml至1.5 ml离心管，平行抽提两份，按1.4①-⑥抽提质粒，将⑥后的两份平行抽提的上清各600 μl收集于1.5 ml离心管，于同一吸附柱内分两次进行⑦，后续步骤与1.4相同。

1.6 取4×0.35 ml菌液抽提质粒

分别从各瓶取菌液0.35 ml至1.5 ml离心管，平行抽提四份，按1.4中①-⑥抽提质粒，将⑥后的四份平行抽提的上清各600 μl收集于5 ml离心管，于同一吸附柱内分4次进行⑦，后续步骤与1.4相同。

1.7 质粒的双酶切反应

1.4 ml，2 × 0.7 ml，4 × 0.35 ml菌液抽提的pET-28a经 NanoDrop 2000测定浓度分别为116，125，130 ng/μl;pET-28a-G6PD 的浓度分别为 120，134，145 ng/μl。用灭菌超纯水将所有质粒稀释至116 ng/μl。酶切体系:空质粒(或重组质粒)1 μg，Nde Ⅰ、Xho Ⅰ各 1 μl，10 × FD Green Buffer 2 μl，加水至 20 μl。混匀，37 ℃酶切 1 h。

1.8 双酶切质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定

配制1.2%的琼脂糖凝胶。将2 μl 1 kb DNA ladder marker(与13 μl 1 ×TAE 及 3 μl 6 ×Loading Buffer混匀)、双酶切的 pET-28a、双酶切 pET-28a-G6PD全量加入上样孔，130 V电泳30 min。

1.9 质粒纯度的测定

利用NanoDrop 2000测定三种策略抽提的质粒pET-28a和 pET-28a-G6PD 的OD260、OD280值，评估质粒纯度。

1.3-1.9的实验进行4次重复(独立实验)。

2 结果

2.1 双酶切后的质粒电泳图谱

按策略1.4，1.5，1.6 抽提的质粒酶切后电泳图谱见图1。可知，按1.4策略抽提的质粒pET-28a和pET-28a-G6PD双酶切后均严重弥散，尽管第2泳道中酶切产生的大片段(略大于5 000 bp)、小片段(介于1 000-2 000 bp)分别与pET-28a(5 239 bp)、G6PD分子量(1 548 bp)相符，但其相对亮度与理论不符;按1.5策略抽提的pET-28a酶切后在＜1 000 bp范围内弥散明显减少，pET-28a-G6PD酶切后的弥散有明显改善，大片段的亮度明显高于小片断;按1.6策略抽提的pET-28a和pET-28a-G6PD酶切后的弥散几乎完全消失，pET-28a-G6PD酶切产生的大、小片段亮度比值接近理论值。

2.2 质粒纯度测定

图1 不同抽提策略的质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳图谱Figure 1 Agarose gel electrophoresis of plasmids after double digestion by different strategies of plasmid extraction

策略1.4，1.5，1.6 抽提的质粒 pET-28a 和 pET-28a-G6PD的4次实验的OD260/OD280平均值分别为1.36 和 1.45，1.65 和 1.70，1.75 和 1.78。可见，菌液越少，质粒的纯度越高，所含蛋白杂质越少。

3 讨论

质粒的双酶切和琼脂糖凝胶电泳的原理简单，易于掌握;但要获得理想的琼脂糖凝胶电泳图片，需要在多个环节上下功夫。导致电泳图片效果不佳的原因很多，有些无法从文献找到答案，需根据具体情况分析，并用实验检验。酶切后弥散是琼脂糖凝胶电泳常见的实验现象之一，导致弥散的原因有:①质粒DNA中含有DNase，在酶切缓冲液的Mg2+作用下激活，水解质粒［3］。②不正确的酶切，如酶用量过多、酶切时间过长、酶切缓冲液错误，导致质粒被切碎。③不合理的电泳缓冲液，如缓冲液陈旧、缓冲液配制错误(如pH和盐离子浓度错误)。④琼脂糖凝胶配制错误。

本研究所用菌株Top10为end A(编码非特异性DNA内切酶Ⅰ)突变型，同时溶解质粒的超纯水均为灭菌后一次使用，可排除DNA酶对质粒的降解。随着优质的限制性内切酶及其通用缓冲液的出现，酶切操作极为简便，不正确酶切发生的概率很小。即用型商品化电泳缓冲液的推出，极大减少了因缓冲液和琼脂糖配制错误所致的弥散。为此，笔者推测电泳弥散与上述四个原因无关，可能是质粒纯度低所致。

虽然试剂盒法提取质粒速度快、纯度高［4］，但仍有不少细节需要在操作时注意。如说明书要求取过夜培养的菌液1.5-5 ml用于质粒的抽提，其中过夜培养是一个模糊时间，8-16 h均可认为是过夜培养，不同过夜培养时间导致的菌液浓度相差悬殊。此外接种时菌落的生长状态和大小，以及菌株的生长速度均会导致相同培养时间菌液浓度不一。故需要摸索菌液用量，调整抽提策略，而不能“尽信书”。在按照 1.4，1.5，1.6 的策略抽提时，发现向1.4 ml菌液所含菌体中加入溶液P2裂解后，需要在颠倒混匀后静置4 min，菌体才变为透明的溶液;用0.7 ml或0.35 ml菌液抽提质粒时，加入溶液P2颠倒混匀后，立即变为澄清溶液，无需静置，且三种策略裂解的菌液澄清度依次增加。如只取1.4 ml菌液抽提质粒，不进行菌液用量的比较，很容易认为1.4的透明溶液就是澄清溶液，就继续后续的操作步骤。

如不测定质粒纯度，贸然进行酶切操作，极易导致酶切鉴定图片质量不佳，甚至导致无法观察到酶切产生的目的条带，严重影响结果的判断。同时，不纯的重组质粒严重影响测序［5］。纯度测定表明，等量的菌液分成小份多次抽提所得到的质粒纯度逐步提高，酶切后电泳弥散现象逐步消失。其原因可能是分次抽提时，菌体充分裂解，蛋白和基因组DNA充分变性，在加入溶液P3后变性的蛋白和基因组DNA沉淀更完全，故蛋白质和基因组DNA污染减少;同时因裂解单位质量的菌体所用的溶液P1(含有RNA酶)增多，RNA也清除得更彻底。

总之，通过本文的研究，笔者发现采用双酶切联合琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒时，质粒的抽提策略对酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散有显著影响。用过多的菌液抽提质粒，因裂解不充分，导致菌体蛋白等杂质难以去除，所提质粒纯度低，易导致双酶切后琼脂糖凝胶电泳弥散。

［1］蒋俊豪，贺修胜.PCR-双酶切鉴定STGC3抑癌基因重组子假阳性研究［J］.现代生物医学进展，2007，7(6):819-823.

［2］曹秀华，王亚婷，李丽，等.琼脂糖凝胶电泳的条件优化—质粒DNA重组片段的限制性内切酶谱鉴定［J］.齐齐哈尔医学院学报，2011，32(01):9-11.

［3］萨姆布鲁克J，拉赛尔DW.分子克隆实验指南［M］.3版.黄培堂，译.北京:科学出版社，2002:35.

［4］马滋蔓，王文治，杨本鹏，等.农杆菌质粒DNA的间接酶切鉴定［J］.生物技术通报，2009，(7):171-173.

［5］毛伟华，高其康.水稻大规模质粒测序影响因素分析［J］.中国水稻科学，2004，18(5):420-424.