OK-432肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠B细胞免疫效应的影响

武 峰，冯振明，康 仟，田国兵(山西医科大学口腔医院修复科，太原 0000;山东省东营市市直机关医院口腔科;山西省人民医院口腔内科;通讯作者，E-mail:tianguobing007@6．com)

肿瘤的发生发展与机体的免疫功能息息相关，当肿瘤发生后，机体可产生针对肿瘤抗原的特异性免疫应答，其中体液免疫发挥着重要的作用，而B淋巴细胞的基本功能是当机体受抗原刺激后参与体液免疫，此外，B细胞还能代替树突状细胞作为抗原提呈细胞(APC)参与肿瘤免疫应答［1］。因此本研究利用DMBA/巴豆油二阶段诱癌法建立DBA/2小鼠鳞状细胞癌荷瘤模型，在此肿瘤模型的基础上分组并进行药物干预，通过测定各组小鼠外周血中B淋巴细胞的含量，从而分析OK-432肿瘤细胞疫苗如何激活机体对肿瘤的体液免疫应答，为寻找OK-432肿瘤细胞疫苗可能的作用机制提供实验理论基础，同时为鳞状细胞癌的免疫治疗提供新思路。

1 材料与方法

1．1 瘤株和实验动物

KLN-205细胞株(DBA/2小鼠来源的肺癌细胞)，购自上海爱丁堡生物科技发展有限公司。KLN-205肿瘤细胞在37℃，5%CO2恒温箱传代培养，选取培养4代以上活力旺盛的肿瘤细胞作为靶细胞。雌性DBA/2小鼠75只，清洁级，7周龄，约(20±2)g，购自北京维通利华科技有限公司。

1．2 制备疫苗和建立模型

采用Li等［2］的方法，用戊二醛(GA)作为桥连剂将OK-432与KLN-205细胞结合，制成OK-432肿瘤细胞疫苗。参照Bollag［3］的实验方法并略加改动，采用 7，12－二甲基苯蒽(DMBA)/巴豆油二阶段诱癌法建立DBA/2小鼠皮肤癌荷瘤模型。

建模具体方法如下:①实验前准备:在涂DMBA前1 d用脱毛剂处理所有小鼠背部皮肤的相同部位，范围大小约2 cm×3 cm。注意脱毛剂停留的时间，防止对小鼠背部皮肤造成灼伤。②实验始发阶段:实验第1，7，14天，将配置好的 DMBA丙酮液(150 μg/200 μl)涂抹于脱去毛发后小鼠暴露的背部皮肤，每只涂抹200 μl。③实验促癌阶段:第5周起，于每周二、周五，在小鼠暴露的背部皮肤的相同部位涂抹0．25%巴豆油丙酮液，每只涂抹200 μl。定时观察肿瘤发生发展的情况和荷瘤鼠数。④造模时间:造模时间总共为18周。

1．3 实验分组及B细胞检测

选取48只长出肿瘤的荷瘤小鼠随机分为3组:OK-432疫苗组、OK-432组和空白对照组，每组16只。各组小鼠于左侧腹腔分别注射浓度为5×105个/100 μl的 OK-432 肿瘤细胞疫苗 100 μl，0．7 KE(OK-432 计量单位)/100 μl的 OK-432 100 μl，PBS液100 μl，每周注射1次，连续注射3周。于末次注射后第1，3，7，14天，每组随机选择4只 DBA/2小鼠进行眼球采血，流式细胞术中利用APC荧光素标记抗小鼠CD45R/B220单克隆抗体(购自美国BD公司)检测小鼠外周血中B细胞含量。

1．4 统计方法

2 结果

末次注射药物后第 1，3，7，14 天，OK-432 疫苗组小鼠外周血中B淋巴细胞含量变化的总趋势为:第1天到第3天时上升较平缓;第7天时明显升高，第14天时较第7天有所降低，且在各个时间点较空白对照组和OK-432组均明显升高(P＜0．05);OK-432组与空白对照组前3 d差异不明显(P＞0．05)，第7天和第14天时较空白对照组明显增高(P＜0．05，见表1、图1)。

表1 末次给药后14 d内小鼠外周血中B细胞的含量(±s，%)Table 1 The content of B cells in peripheral blood in mice within 14 d after the last administration(±s，%)

表1 末次给药后14 d内小鼠外周血中B细胞的含量(±s，%)Table 1 The content of B cells in peripheral blood in mice within 14 d after the last administration(±s，%)

与空白对照组相比，*P ＜0．05;与 OK-432组对比，#P ＜0．05

组别 第1天 第3天 第7天 第14天空白对照组 28．78 ±0．81 30．20 ±1．13 30．15 ±1．10 32．77 ±0．70 OK-432 组 29．26 ±1．04 30．32 ±0．84 39．59 ±1．43* 39．65 ±0．74*OK-432 疫苗组 31．90 ±1．65*# 34．04 ±1．09*# 42．80 ±0．65*# 42．30 ±0．97*#

图1 小鼠外周血中B淋巴细胞含量变化趋势图Figure 1 The changes of the content of the B lymphocytes in peripheral blood in mice

3 讨论

OK-432(Picibanil)为细菌类非特异性免疫调节剂，已经大量应用于临床良、恶性肿瘤的治疗，并具有良好的安全性，包括口腔癌。KLN-205细胞源于DBA/2小鼠的鳞状细胞癌细胞系，通过架桥剂戊二醛把KLN-205细胞和OK-432结合形成自体肿瘤细胞疫苗，不仅带有肿瘤组织所具有的免疫原性和特异性，还具有和正常组织相同的相关白细胞抗原，不会引发机体的免疫排斥反应。OK-432肿瘤疫苗是利用OK-432直接杀伤癌细胞的作用，通过菌体与癌细胞的直接接触，使肿瘤细胞变性并暴露瘤细胞“隐藏”着的某些抗原决定簇，从而达到增强肿瘤抗原性的目的［2］。

癌症的发生一般分为始发阶段、促癌阶段和演化阶段。本研究首先利用DMBA/巴豆油二阶段诱癌法建立DBA/2小鼠鳞状细胞癌荷瘤模型。DMBA是一种多环芳香烃，单独应用可诱导仓鼠颊囊癌变［4］，也可以诱导大鼠乳腺癌［5］等肿瘤的发生。巴豆油中富含12-O－十四烷酰佛波醇－13－乙酯(TPA)类物质，Fu等［6］研究表明当其作用于皮肤组织会导致皮肤组织中大量的巨噬细胞渗出，出现明显的炎症反应，同时伴有活性氧自由基的释放，在促癌过程中起着重要的作用。因此，DMBA/巴豆油二阶段法诱癌过程与人类癌症的发生发展相似，说明DMBA/巴豆油二阶段诱癌法建立的DBA/2小鼠鳞状细胞癌荷瘤模型是一种较为理想的实验动物模型，为后续实验奠定了基础。

肿瘤的发生发展是与机体的免疫息息相关的。当肿瘤发生以后，机体可针对肿瘤抗原产生特异性的免疫应答，但随着肿瘤的发生发展，机体的免疫功能就受到抑制［7］。我们采用主动免疫治疗，以期增加肿瘤抗原的免疫原性，克服免疫抑制状态，增强机体免疫功能。总的来说，机体的免疫分为细胞免疫和体液免疫，在本实验中主要探讨体液免疫的作用，B细胞在体液免疫中通过活化为浆细胞，进而分泌抗体来达到保护机体的目的。因此，本实验在DBA/2小鼠肿瘤模型的基础上，通过分组药物干预，测定小鼠外周血中B淋巴细胞从而判断OK－432肿瘤细胞疫苗的治疗作用。

CD45R/B220是小鼠B细胞最常用的表面标记，该抗原的分布具有限制性，主要表达在B细胞(包括前B细胞)上，也有少部分表达于T细胞和单核细胞。B细胞可能通过以下途径参与肿瘤免疫:(1)B细胞介导的体液免疫:主要通过分泌IgM、IgG、IgG2b等抗体来实现，Li等［8］研究表明，B 细胞分泌的IgG2b抗体对MCA205肿瘤细胞可以产生抗肿瘤作用;(2)作为抗原提呈细胞(APC):B细胞除产生抗体以外还有一个重要的功能——提呈抗原，而且经CD40活化的B细胞对于巨噬细胞和树突状细胞所不能有效摄取的可溶性抗原仍能通过内化加工提呈给T细胞［9］。本实验中OK-432疫苗组在末次注射疫苗后第1、3、7、14天时，外周血中的B细胞含量较空白对照组和OK-432组均有明显升高(P＜0．05)，说明OK-432肿瘤细胞疫苗能增加B细胞的含量，增强机体的体液免疫应答，且较单独应用OK-432效果好。

综上所述，OK-432肿瘤细胞疫苗可以增强机体的体液免疫应答，克服免疫抑制状态，增强机体免疫功能。但目前OK-432肿瘤细胞疫苗具体的抗肿瘤作用机制仍不明确，这有待于进一步的研究。

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