乳杆菌代谢产生抑菌物质的特性研究

陈忠军，高鹤尘，李海瑄

（内蒙古农业大学食品科学与工程，呼和浩特010018）

0 引言

乳杆菌是一类能从可发酵碳水化合物（主要指葡萄糖）产生大量乳酸的细菌的总称[1]。乳酸菌作为重要的益生菌已广泛地用于医药、食品和饲料等行业中,被公认为是安全的(generally regarded as safe,GRAS)食品级微生物[2]，历来被用作食品的天然生物防腐剂。天然防腐剂具有安全无毒、抗菌性强、水溶性好、耐热性好、应用范围广等优点,这是合成防腐剂所无法比拟的[3]。乳酸菌可以产生有机酸、过氧化氢、细菌素等多种天然抑菌物质[4-6],抑制一些腐败菌或致病菌的生长。延长食品的货架期[11-12]。目前主要被认定的有效抑真菌物质有：有机酸、罗氏菌素、过氧化氢、蛋白类短肽、羟基脂肪酸等、和酚类化合物[7]。

本研究旨在筛选出对酵母有抑制作用的乳酸菌，对其产生的抑菌活性物质的特性进行研究，为进一步提取和纯化抑菌活性物质奠定基础[8]。

1 实验

1.1 材料

（1）乳酸菌为ALAC-1，ALAC-2，ALAC-3，ALAC-4，ALAC-5。指示菌为白假丝酵母（Candidaalbicans)。

（2）乳酸菌培养基：MRS培养基，指示菌培养基，YEPD培养基，抑菌活性检测培养基，水琼脂培养基，TSB培养基。

（3）试剂：过氧化氢酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K，蛋白胨，牛肉膏，大豆蛋白胨，酵母提取粉，胰蛋白胨，无水乙酸钠，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰，柠檬酸氢二铵，NaOH，无水葡萄糖，其他化学试剂。

（4）仪器：移液器；FLC—3型超净工作台，BCD—221BSY冰箱，HVE—50型全自动高压灭菌锅，HPS—250生化培养箱，12001型上皿电子天平，旋转蒸发仪，LG10—2.4A型离心机。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌代谢产物的制备

将穿刺保藏的乳酸菌接种到5 mL的MRS液体培养基中活化一代，37℃培养16～24 h，将发酵后的发酵液离心（3 000 r/min，10 min），将上清液用旋转蒸发仪进行浓缩至25倍，取浓缩液进行实验[9]。

1.2.2 指示菌菌悬液的制备

将斜面保藏的白假丝酵母菌用灭菌后的接种环挑到灭菌的生理盐水中，调至浓度为102mL-1，并混匀，得到供试菌悬液。

1.2.3 抑菌活性的测定

用牛津杯法将融化的水琼脂培养基倒入无菌平皿中，每个10 mL左右，待凝固后，将灭菌后的牛津杯用灭菌后的镊子放在水琼脂上。然后将含有酵母的TSB固体培养基倒入平皿中，每个25 mL左右。待TSB凝固后，取出牛津杯，加入200 μL的乳酸菌浓缩液，30℃培养24 h，用游标卡尺量取抑菌圈直径（包含牛津杯外径（7 mm）取平均值后的数据为准）。

1.2.4 乳杆菌排酸后的抑菌效果

将5株乳酸菌的发酵液用浓度为1 mol/L的NaOH调至pH值为4.5，5.0，5.5后，经离心旋转蒸发浓缩25倍，取浓缩液测定抑菌活性。

1.2.5 代谢产物热处理后的抑菌效果

将筛选的乳酸菌的发酵液分别置于45，55，70，85，100℃的水浴锅中处理10 min，离心（4 000 r/min，10 min），将上清液用旋转蒸发仪浓缩25倍，测定其抑菌活性，同时设未经处理的代谢产物作为对照。

1.2.6 代谢产物紫外线辐射后的抑菌效果

将乳酸菌的发酵液分别经过5，10，15，20，25 min的紫外线射线辐射，（其瓦数为150 w，电源电压AC220V/50Hz），离心，将上清液用旋转蒸发仪浓缩25倍，测定其抑菌活性，同时设未经处理的代谢产物作为对照。

1.2.7 代谢产物经金属离子处理后的抑菌效果

将 K+，Na+，Mg2+，Mn2+，Ca2+金属离子分别加入到乳酸菌培养基中进行发酵，离心（4 000 r/min，10 min），将上清液用旋转蒸发仪浓缩25倍，测定其抑菌活性，同时设未经处理的代谢产物作为对照。

1.2.8 代谢产物经酶处理后的抑菌效果

将所用酶用磷酸盐缓冲液(pH值为7.2,浓度为1 mol/mL)配制成质量浓度0.5g/L酶液。用浓度为5 mol/L的NaOH和HCl调至各酶最适pH值（表1）。取浓缩代谢产物3 mL，分别加入过氧化氢酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K酶液0.5，1，1.5，2 mL，在37℃下反应2 h后，调pH值至代谢产物初始pH值。并用旋转蒸发仪浓缩至原始体积，测定其抑菌活性，同时设未经处理的代谢产物作为对照。

2 结果与分析

2.1 经排酸后乳杆菌代谢产物的抑菌活性

以酵母菌为指示菌，将5株乳酸菌代谢产物经排酸后测定其抑菌活性，结果如表2所示。

表2 不同pH值的抑菌圈的直径 mm

由表2可以看出，5株乳酸菌代谢产物对酵母菌均有抑制作用。其中ALAC-1，ALAC-2，ALAC-5在pH值为4.5以上对指示菌无抑菌效果，说明抑菌活性物质可能为酸。ALAC-3和ALAC-4分别在pH值为5.0和pH值为5.5时仍有抑菌效果，说明抑菌活性物质除了酸还有其他抑菌物质的存在。所以，在后期实验中，将ALAC-3和ALAC-4作为实验菌株。

2.2 代谢产物热处理后的抑菌活性

以酵母菌为指示菌，将ALAC-3和ALAC-4代谢产物分别经过45，55，65，75，85 ℃处理10 min后，测定抑菌活性，结果如图1所示。

图1 ALAC-3和ALAC-4在不同温度处理下的抑菌效果

由图1可以看出，代谢产物经过 45，55，65，75，85℃不同温度处理后，抑菌活性均有一定程度的下降。ALAC-3菌株在55℃处理时抑菌活性达到最低值，抑菌圈为23.61 mm，仍有抑菌性。ALAC-4菌株的抑菌活性随着温度升高缓慢的下降，但抑菌圈仍在30 mm左右，仍有较强的抑菌性。说明2株菌所产抑菌活性物质具有良好的热稳定性。

2.3 代谢产物紫外线辐射后的抑菌效果

以酵母菌为指示菌，ALAC-3和ALAC-4代谢产物分别经过5，10，15，20，25 min紫外线辐射后，测定抑菌活性，结果如图2所示。

由图2可以看出，ALAC-3菌株代谢产物经过紫外线辐射不同的时间后，抑菌圈直径呈下降的趋势。经25 min处理后，抑菌圈由最初的33.47 mm降为28.87 mm，下降了13.74%，仍有较强的抑菌性。ALAC-4菌株经过辐射不同的时间后，抑菌圈直径到10 min上升，10 min后总体呈下降的趋势。处理25 min后，抑菌圈由最初的34.91 mm降为23.96mm，下降了31.37%，仍有较强的抑菌性。说明ALAC-3和ALAC-4代谢产物对于紫外线辐射不是很敏感。

图2 ALAC-3和ALAC-4在紫外线辐射后的抑菌效果

2.4 代谢产物经金属离子处理后的抑菌效果

以酵母菌为指示菌，在ALAC-3和ALAC-4菌株培养基中分别加入K+，Na+，Mg2+，Mn2+，Ca2+后进行发酵，测定抑菌活性，结果如图3所示。

图3 金属离子对ALAC-3和ALAC-4抑菌效果的影响

由图3可以看出，Ca2+和Mn2+对ALAC-3代谢产物的抑菌作用起促进作用；而加入K+，Na+，Mg2+的ALAC-3抑菌圈直径明显小于未处理的，说明K+，Na+，Mg2+对ALAC-3代谢产物的抑菌作用起抑制作用。ALAC-4加入K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Mn2+后，抑菌圈直径明显小于未处理的，说明K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Mn2+对ALAC-4代谢产物的抑菌作用起抑制作用。

2.5 代谢产物经酶处理后的抑菌效果

添加不同量的酶后，测定抑菌活性。进行比较后，将1mL作为酶的最适添加量。以酵母菌为指示菌，过氧化氢酶处理ALAC-3和ALAC-4代谢产物，测定抑菌活性，结果见图4。排除过氧化氢干扰后，用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K处理ALAC-3和ALAC-4代谢产物，测定抑菌活性，结果如图5和图6所示。

图4 ALAC-3和ALAC-4经过氧化氢酶处理后的抑菌活性

由图4可以看出，ALAC-3和ALAC-4代谢产物经过氧化氢酶处理后，抑菌活性都有所降低。ALAC-3由22.79 mm降为16.61 mm，下降了27%。而ALAC-4由26.13 mm降为12.61 mm，下降了52%，说明过氧化氢是抑菌物质中的一种成分。排除了过氧化氢的干扰后，其代谢产物仍有抑菌活性，说明抑菌物质中还有其他起抑菌作用的成分。

图5 ALAC-3经过不同蛋白酶处理后的抑菌活性

图6 ALAC-4经过不同蛋白酶处理后的抑菌效果

由图5和图6可以看出，ALAC-3和ALAC-4菌株代谢产物经过木瓜蛋白酶处理，抑菌活性分别降低了42%和18%；蛋白酶K处理后，ALAC-3的抑菌活性没有受到影响，ALAC-4抑菌活性降低了8%；胰蛋白酶处理后，抑菌活性分别降低了63%和43%；胃蛋白酶处理后，抑菌活性分别降低了16%和21%。说明ALAC-3和ALAC-4代谢产物对蛋白酶敏感，所以抑菌物质可能是一种蛋白类物质。

3 讨论

本研究以酵母菌为指示菌，经排酸筛选出两株具有抑酵母作用的乳酸菌ALAC-3和ALAC-4。两株乳酸菌在排除酸的影响后仍有抑菌效果，说明代谢产物中除了酸以外，还有其它抑菌物质的存在。ALAC-3、ALAC-4代谢产物经不同温度处理后，抑菌活性略有降低，说明其热稳定性较好，且对紫外线辐射不太敏感。Ca2+和Mn2+对ALAC-3代谢产物的抑菌作用起促进作用，而K+，Na+，Mg2+对其抑菌作用起抑制作用。K+，Ca2+，Na+，Mg2+，Mn2+对ALAC-4代谢产物的抑菌作用都起抑制作用。排除过氧化氢干扰后，菌株代谢产物仍有抑菌活性，说明代谢产物产物中除了酸和过氧化氢，还存在其他抑菌物质。代谢产物经木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶处理后，抑菌活性有不同程度的降低，说明抑菌物质对蛋白酶敏感，有可能是一种蛋白类的抑菌物质。目前，人们发现的具有抑真菌活性的乳酸菌能产生有机酸、

过氧化氢以及一些其它具有抑真菌作用的低分子量化合物[10]。但是对于乳酸菌产生的蛋白质类抑真菌作用的研究甚少，所以本实验为进一步分离纯化蛋白类抑菌物质以及其结构的确定奠定了基础。

[1]黄现青,高晓平,韩庆功,崔艳红.乳酸菌类细菌素的研究进展[J].中国乳品工业,2007,09:41-43.

[2]WASSENAAR T M,KLEIN G.Safety A spects and Implications of Regulation of Probotic Bacteria in Food and Food Supplements[J].J.Food Prot,2008,71(8):1734-1741.

[3]史沁红,李青.天然食品防腐剂—细菌素[J].肉类研究,2008,10:44-47.

[4]GULAHMADOV S G,ABDULLAEVA N F.GUSEINOVA N F,et al.Isolation and characterization of bacterioCin-like inhibitory Substances from lactic acid bacteria isolated from azerbaijan cheese[J].Applied Biochemistry and Microbiology,2009,45（3）:266-271.

[5]胡杨,项松涛,杨宇清,郑一敏,王琳琳,胥秀英,曾品涛,李杰.泡菜中产细菌素的乳酸菌分离研究[J].西南大学学报(自然科学版),2012,34（3）:144-148.

[6]郭本恒.益生菌[M].北京:化学工业出版社,2004:5-120.

[7]DALIE D K D,DESCHAMPS A M,RICHARD-FORGET F.Lac⁃tic acid bacteria:potential for control of 1 mould growth and my cotoxins:a review[J].Food Control,2010,21（4）:370-380.

[8]于娜,陈忠军.具有抑菌作用乳酸菌的筛选及其抑菌物质特性的研究[J].食品科技,2011,05:13-17.

[9]傅倩倩.添加具有抑制霉菌特性乳酸菌生产酸奶工艺条件的研究[D].内蒙古农业大学,2013.

[10]陈章庭,崔艳华,张兰威,曲晓军.抗真菌乳酸菌研究[J].食品工业科技,2012,06:425-428.