生鲜乳中β-内酰胺酶微生物法检测

李欣南，韩镌竹，苏崴艺

（辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，沈阳110016）

0 引言

生鲜乳是当前百姓生活中不可缺少的食品之一，但是随着饲料产品及投入成本的增加，造成许多不法商贩向生乳中掺入糊精、三聚氰胺、植物末和β-内酰胺酶等有毒有害物质[1-3]，给消费者的身体健康带来潜在的危害。其中β-内酰胺酶是微生物产生的，主要作用于β-内酰胺类抗生素的一类酶。该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素，使青霉素、头孢菌素等抗生素药物耐药性增高，长期使用的危害还没有明确的报道，但是作为细菌耐药性机制之一，其有可能诱导人体内正常菌株的耐药性的产生，从而降低人们抵抗传染病的能力。

1 β-内酰胺酶检测方法及原理

现阶段，生鲜乳中β-内酰胺酶的检测方法采用的是卫生部制定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法杯碟法》[4-5]，该方法可以检测出生鲜乳中未反应完全的β-内酰胺酶，可用于检测未经过任何加工的牛奶，并且检出限较低，容易区分外源性和内源性β-内酰胺酶。其检测原理是以一种对青霉素高度敏感的细菌作为指示菌，实验时如果被测牛奶样品含有青霉素酶，破坏了青霉素，指示菌株即可生长，否则指示菌将被抑制。同时，通过与标准品比对抑菌圈的大小，可以定量地确定β-内酰胺酶的含量[6-7]。崔生辉等[8]运用β-内酰胺酶特异性抑制剂舒巴坦建立了该酶的检测方法，该方法在牛奶中的检出限为4 U/mL。目前，微生物法仍然是实验室检测牛奶中β-内酰胺酶的主要方法。

2 方法

参照农业部指定的《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法杯碟法》[4]。

2.1 标准物质控制[9]

（1）青霉素的工作液的制备。青霉素标准品应按百分含量折算后进行称量，标准溶液应当现用现配，确保容量瓶无残留，防止交叉污染。

（2）舒巴坦工作液的制备。舒巴坦的标准溶液配制后可分装冷冻保存一周，避免反复冻融，配制时应确保容量瓶无残留，防止交叉污染。

（3）β-内酰胺酶工作液的制备。β-内酰胺酶标准品应进行活力测定或购买标注活力单位的标准品。β-内酰胺酶活力测定参见中国兽药典一部附录128—青霉素酶及活力测定法，配制及洗刷时应单独操作，避免污染容器和操作界面。一般工作液浓度应控制在4000～6000 U/mL。

2.2 菌种控制

采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株藤黄微球菌（CMCC(B)28001），实验菌株应来自认可的国内或国外微生物菌种保藏机构的标准菌株或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生株。刚购置的菌种冻干粉应在-20℃冷冻保存，临用前活化，标准菌株的复活或培养物的制备应按照供应上提供的说明或按已验证的方法进行。活化后的菌种为标准储备菌株应制备培养液，分装后于-20℃以下甘油冷冻保存。标准储备菌株可用于制作每月或每次实验用的工作菌株，工作菌株应在营养琼脂斜面保存，一般可冷藏保存1个月。

菌种传代使用营养琼脂斜面，培养温度为28℃培养48 h。传代后菌株在斜面上应为湿润密布生长，无褶皱和裂纹，亮黄色菌苔。菌种传代不宜超过14代。14代后菌种的活力下降会给检验结果带来误差。超过14代应重新挑取液体保存菌种重新传代。

2.3 器皿控制

检测中所用器皿及耗材，如培养皿、试管、牛津杯等应清洗干净，不得有清洁剂等抑菌物质残留。

（1）实验用培养皿。培养皿应为内径为90 mm的玻璃平皿，高度应大于20 mm，避免加入牛津杯后总高度高出平皿边缘。

（2）实验用陶土盖。由于陶土盖受潮后会变形，因此在每次使用前应挑出不符合规定的陶土盖，高温干热灭菌180℃维持2 h，以除去分和杀灭污染的微生物。

（3）实验用牛津杯。牛津杯应彻底清洗，避免蛋白质和脂肪等物质残留牛津杯内壁，影响样品的渗透。使用前应使牛津杯在无菌条件下自然冷却后备用。使用后的牛津杯应先超声清洗30 min，然后使用柔软试管刷彻底清洗牛津杯内壁，蒸馏水冲洗干净后晾干，180℃维持2 h高温干热灭菌。

2.4 试剂和培养基控制

（1）无菌水和PBS。采用灭菌的无菌水作为样品的稀释剂，同时也作为空白样品，用以确证没有引入污染。pH值为6.0磷酸盐缓冲液使用灭菌蒸馏水配置，用于稀释β-内酰胺酶标准品、青霉素标准品和舒巴坦标准品。

如空白样品平皿出现阳性结果则无菌水可能被污染，应重新配置、检测。

（2）培养基。菌种培养使用营养琼脂培养基，工作培养基使用抗生素Ⅱ号培养基。培养基的验证、配置参见《SN/T 1538.1培养基制备指南第1部分实验室培养基制备质量保证通则》和《SN/T 1538.2培养基制备指南第2部分培养基性能测试实用指南》。

2.5 操作步骤控制

2.5.1 工作菌悬液的制备

用0.85%的无菌生鲜乳将斜面上的菌苔润洗，使用移液管反复吹洗至均匀分散，至终浓度约为1×1010cfu/mL，菌悬液可放置4℃保存1周。菌悬液使用时可提前放置37℃水浴锅中预热，防止与抗生素培养基Ⅱ混合时造成培养基凝固。

2.5.2 工作平皿的制备

用于倾倒平皿底层的抗生素培养基Ⅱ，应充分融化并保温于55±5℃恒温水浴中，倾倒底层体积为10 mL，倾倒后应放置一段时间使琼脂充分凝固同时表面的水蒸气充分挥发后，加盖备用。

用于倾倒上层的抗生素培养基Ⅱ，应充分融化并保温于55±5℃恒温水浴中，倾倒上层体积为5 mL。水浴温度太高影响细菌生长，太低琼脂易凝固成小颗粒，倾倒平面后培养基表面凸凹不平，加入牛津杯后，表面与牛津杯接触有空隙，会产生漏液的现象。培养基在恒温后加入适量菌悬液并充分混匀，避免结果产生误差。

2.5.3 样品的制备

（1）样品应放置-20℃以下冷冻保存，不宜反复冻融。避免因细菌污染造成的结果误差。

（2）每次取样时应注意避免带入生鲜乳中固体物质而影响加样和样品的渗透。

（3）建议样品的pH值应控制在7.6～8.0，此条件下一些嗜酸性微生物往往不易生长。

（3）样品中标准物质的加入顺序不能改变。

（4）每次加入标准物质都应更换新的枪头避免交叉污染。

（5）每种标准物质加入后应及时振荡，使其充分溶解。

（6）样品制备好后，应立即加样。

（7）每次实验应使用无菌水作为空白。

2.5.3 加样

（1）工作台面应保持水平，且不能震动。

（2）牛津杯放置时牛津杯间的距离应均一，避免影响结果测量，建议使用牛津杯放置器。牛津杯放置后尽量不要移动。

（3）加样时间不宜超过20 min，即从在工作平皿中加入牛津杯到加入样品的时间。

2.5.4 培养

恒温培养箱内的底板应保持水平，防止因底板不平而造成的漏液。培养温度37±1℃培养箱内的温度应均一，避免因温度不均匀而影响工作菌株的生长，造成结果的误差。

3 结果

使用游标卡尺或抑菌圈测量仪测定抑菌圈的大小并记录结果。三个平行样的结果应平行，0.5μg/mL的青霉素抑菌圈的大小应控制在18～22 mm之间，过大或过小应调整工作菌浓度。图1为正常状态下阴性对照水的结果，图2为阳性样品的结果。

（1）当空白结果异常时：①如果A、B、D都没有圈，可能是青霉素标准品失效，应该更换青霉素标准品；②如果A没有圈，B、C、D正常，则可能是污染，应重新检测；③如果B没有圈，A、C、D正常，则可能是污染，应重新检测；④如果C有圈，可能是β-内酰胺酶失效，应该更换酶储备液；⑤如果D没有圈，A、B、C正常，则可能是β-内酰胺酶与舒巴坦比例不合适，应调整使β-内酰胺酶与舒巴坦恰好作用；

图1 阴性对照水结果

图2 阳性奶样结果

（2）当空白结果正常，样品中如果A、B和D没有圈，可能是样品中β-内酰胺酶含量过高，应将样品稀释。

4 讨论

杯碟法检测生鲜乳中的β-内酰胺酶虽然操作繁琐，但其准确性却很高，只要严格控制标准物质和操作步骤，均能得到满意的检测结果。本文主要针对生鲜乳样品，阐述了标准物质控制、样品制备和具体操作等各个环节的注意事项，尤其是样品的制备和结果判读的几点经验之谈可为实际操作者提供较好的参考，避免结果的误判。

[1]沈赟,符晓梅,乔昕，等.南京市乳制品中β-内酰胺酶类药物残留状况调查[J].江苏预防医学,2010,21(4):6-8.

[2]王荣耕.使青霉素重振雄风的β—内酰胺酶抑制剂[J].精细与专用化学品,2000,8(18):16-17.

[3]马景宏,张旭,赵虹，等.沈阳市售乳制品中β-内酰胺酶残留状况初探[J].中国微生态学杂志,2012,24(007):606-608.

[4]乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质检验方法杯碟法[S].卫生部公报，2009,7:25-28.

[5]李延华,王伟军,张兰威等.微生物法检测生鲜乳中β-内酞胺类抗生素残留的对比研究[J].中国抗生素杂志，2009,34(1):63-64.

[6]陈号,马文静,田晋红，等.牛奶中非法添加β-内酰胺酶的检测方法及研究现状[J].畜牧与饲料科学，2010,31(1):67-69.

[7]邓冬云,陈萍,邵昭明，等.牛奶中β-内酰胺酶两种检测方法的比较[J].职业与健康，2012,28(5):548-349.

[8]崔生辉,李景云,马越，等.“生鲜生鲜乳抗生素分解剂”的鉴定与检测[J].中国食品卫生杂志，2007,19(2):113-116.

[9]马玉华.关于《乳与乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检测方法—杯碟法》的经验探讨[J].中国卫生检验杂志,2010(010):2621-2621.