响应面法优化甘薯淀粉酶解工艺及动力学模型研究

高义霞 牛伟强 高小刚 周向军

（天水师范学院生命科学与化学学院，天水 741001）

响应面法优化甘薯淀粉酶解工艺及动力学模型研究

高义霞 牛伟强 高小刚 周向军

（天水师范学院生命科学与化学学院，天水 741001）

研究甘薯淀粉的α－淀粉酶酶解工艺及动力学。以葡萄糖释放率为考察指标，研究酶解时间、酶量、淀粉浓度、pH值及酶解温度对α－淀粉酶酶解甘薯淀粉的影响，利用单因素和响应面法优化酶解工艺。通过Lineweaver－Burk和Wilkinson统计法求解米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm），建立相应动力学模型。结果表明：α－淀粉酶酶解甘薯淀粉最优参数为：时间40min，温度60℃，pH 5.0，酶量0.6 U／mL和淀粉质量浓度5 mg／mL，在此条件下，验证值为（50.676±0.294）%，n＝5，RSD＝0.519%。在 pH 6.0，50℃条件下，活化能（E a）＝31.986 kJ／moL，Km＝0.988 mg／mL，Vm＝0.107 mg／（mL·min）。

甘薯淀粉 酶解 动力学 响应面法

甘薯（Ipomoea batatas L），旋花科甘薯属草本植物，又名山芋、红薯、番薯等，为我国第四大农作物［1］。甘薯富含碳水化合物、蛋白质、维生素、黄酮等，具有增强免疫力和促进肠道蠕动等作用［2－3］。工业上淀粉的糖化主要有酸法和酶法，酸法易受到酸和热的影响而发生复合反应或分解反应，分别生成异麦芽糖、龙胆二糖等低聚糖或5－羟甲基糠醛继而生成甲酸和乙酰丙酸等，因此精制较为困难。酶法具有催化效率高、专一性强和条件温和等特点，日益受到青睐［4］。α－淀粉酶用于水解淀粉获取制糖、发酵行业所需的糖类原料或焙烤类食品品质的改善［5］。利用α－淀粉酶酶解谷物淀粉制备玉米蛋白、米渣蛋白和小麦麸皮蛋白已进入实践阶段［6］。实际生产中，要求准确把握酶促反应的条件以充分发挥酶的催化作用［7］。酶促反应动力学是研究酶促反应速率及其影响因素的学科，在酶的结构与功能、作用机制、反应条件及代谢作用等研究中，具有重要的理论和实践意义［8］。影响酶解的因素主要有酶量、底物浓度、pH值、温度和时间［9］等，李忠海等［10］考虑了酶量、时间、温度和pH值4个因素对甘薯淀粉酶解的影响，但未考虑淀粉浓度对其他因素的交互影响，且该试验是以酶解液中还原糖的含量为考察指标，未考虑糖化值（DE值）。随生淀粉酶等新型淀粉酶的出现，直接选择淀粉颗粒作为底物进行水解成为一种趋势，因此，本试验以葡萄糖释放率为考察指标，探讨时间、酶量、淀粉浓度、pH值和温度对甘薯淀粉α－淀粉酶水解的影响，利用响应面法寻找最优酶解工艺，推导α－淀粉酶水解动力学模型，为甘薯淀粉工业产糖提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘薯淀粉（淀粉质量分数为66%）：北京古松经贸有限公司；α－淀粉酶（58.7 U／mg）：Sigma；酒石酸钾钠：中国莱阳双双化工有限公司；葡萄糖：天津登丰化学品有限公司。

1.2 器材

TGL－20M型高速台式冷冻离心机：湖南湘仪离心机仪器有限公司；PHS－3D雷磁pH值计：上海精密科学有限公司；722型可见分光光度计：上海欣茂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的制作及甘薯淀粉的酶解

参考 3，5－二硝基水杨酸（DNS）法［11］。0.4 mg／mL葡萄糖溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL，加蒸馏水至2mL，混匀，加入1.5mL DNS，沸水浴加热5min，冷却后补至3.5mL。540 nm测定吸光值。最小二乘法拟合得标准曲线为：Y＝5.067 9X－0.052 7，R2＝0.991 6（X为葡萄糖质量／mg，Y为OD）。称取甘薯淀粉，加一定蒸馏水搅拌10min，调至一定pH值。加一定量的α－淀粉酶液，振荡，5min后迅速沸水灭活 5min，5 000 r／min离心 10min，测定吸收值，计算葡萄糖释放率。葡萄糖释放率（%）＝葡萄糖质量浓度（mg／mL）×100／淀粉质量浓度（mg／mL）。

式中：v为反应速率；m／V为葡萄糖质量浓度／mg／mL；t为反应时间／min。

1.3.2 单因素试验

按1.3.1法，分别考察反应体系的pH值（4、5、6、7、8）、时间（5、10、20、40、80min）、温度（30、40、50、60、70℃）、酶量（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 U／mL）及淀粉浓度（0.5、1、2、3、4、5 mg／mL）对葡萄糖释放率的影响。

1.3.3 酶促反应动力学模型

Michaelis和Menten根据快速平衡学说建立米氏方程，Briggs和Haldane用稳态代替快速平衡态，对米氏方程做了修正，得到更合理的酶促反应动力学过程。推导过程简述如下［12］：

式中：k1为ES生成速率；k2、k3分别为ES分解为E＋S和P＋E的速率；k4为E＋P生成ES的速率（反应初期忽略不计）。［S］为底物质量浓度／mg／mL；E总（U／mL）＝［E］＋［ES］。将（6）线性化处理，得Lineweaver－Burk方程，求 Km和Vm；利用Wilkinson统计法求

1.3.4 响应面法优化酶解工艺

在单因素试验的基础上，以酶量、时间、温度、淀粉浓度和pH值为因子，单因素试验各因子最优点为基准点，确定适度步长，葡萄糖释放率为响应值，利用Design－Expert8.06中Box－Behnken法设计五因素三水平响应面优化方案［14］，见表1。

表1 Box－Benhnken试验因素水平及编码

1.4 数据处理

利用origin7.5作图，Design－Expert 8.06进行响应面分析，单因素方差分析采用 Excel 2003（P＜0.05），数据重复3次，以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1a可知，葡萄糖释放率对pH变化曲线为钟罩形曲线（P＜0.01），在pH 4.0～6.0范围内，葡萄糖释放率逐渐增大，pH 6.0时达最大值，说明此时酶的解离状态最有利于与底物结合［15］。在pH 6.0～8.0范围内，释放率逐渐降低，原因是过酸或过碱破坏盐键，使酶活性中心空间构象发生改变而失活。同时，pH值影响酶分子及淀粉分子的解离程度，从而影响酶的稳定性及与底物的结合，进而影响酶的催化作用和反应速度［16－17］，因此选择 pH 6.0。由图 1b可知，随酶量的增加，葡萄糖释放率增大（P＜0.01），这是因为反应起始时淀粉过量，酶量与酶促反应速率成正比，随酶量的进一步增加，葡萄糖释放量逐渐受淀粉浓度的限制，曲线上升平缓甚至下降［18］，此时继续增大酶量对反应速率影响不大［19］，故酶量选择0.5 U／mL。由图1c可知，随时间的延长，葡萄糖释放率先急剧增大，随后缓慢并趋于稳定（P＜0.01），原因是部分葡萄糖重新结合生成异麦芽糖等复合糖，同时，淀粉浓度降低、产物浓度增加加速了逆反应的进行、产物对酶的抑制作用和随时间的延长酶分子失活等［20］。综合考虑葡萄糖释放率及生产周期等因素，选择60min。由图1d可知，温度与释放率曲线为钟罩形（P＞0.05），在30～50℃范围时，随温度的增加，释放率增加，50℃达最大值。随后继续增大温度，释放率下降。因此，温度选择50℃。由图1e可知，随淀粉浓度的不断增加，葡萄糖释放率逐渐减少（P＜0.01），与张国权等［20］研究结果一致。当淀粉浓度较低时，虽然葡萄糖释放率相对较大，但此时酶远未被底物饱和，催化效率相对较低，且淀粉浓度较低时误差较大，故实践意义不大，不予考虑。结合下文可知，淀粉质量浓度为2～4 mg／mL时，底物达到饱和状态，酶促反应速度达到最大，综合考虑，淀粉质量浓度选择4 mg／mL。

图1 单因素试验

2.2 响应面分析

Box－Benhnken设计和结果见表2。对表2数据回归拟合，Y＝35.94＋1.42X1＋1.24X2＋0.42X3＋8.61X4＋1.06X5－2.71X1X2＋0.20X1X3－0.28X1X4－1.33X1X5＋0.42X2X3－2.91X2X4＋1.08X2X5＋0.947，说明响应值的变化有94.7%来自所选变量。失拟项P值为0.364，大于0.05，该模型失拟项不显著，因此方程可用来解释结果并预测最佳工艺条件。方差分析及系数显著性检验分析见表3。方差分析表明，方程具有显著性（P＜0.01）。淀粉浓度（X4）和酶量（X1）“Prob＞F”值 ＜0.01，表明其对葡萄糖释放率的影响极显著；时间（X2）和 pH（X5）的“Prob＞F”值 ＜0.05，影响显著；温度（X3）的“Prob＞F”值 ＞0.05，影响不显著。各因素影响大小依次为淀粉浓度、酶量、时间、pH值、温度。二次项影响显著，交互项影响大小依次为 X2X4、X1X2、X3X5、X1X5、X2X5、X3X4、X2X3、X4X5、X1X4、X1X5，其中 X1X2、X2X4达到极显著水平，其他均不显著，表明各因素对葡萄糖释放率的影响不是简单线性关系。去掉不显著因素，模型为Y＝35.94＋1.42X1＋1.24X2＋8.61X4＋（9）。最优工艺为：酶量 0.6 U／mL，时间 40min，温度58.97℃，淀粉质量浓度5 mg／mL和pH 5.26，预测葡萄糖释放率可达52.5%。为了操作的方便，调整为：酶量0.6 U／mL，时间40min，温度60℃，淀粉质量浓度5 mg／mL和 pH 5.0。试验平均值为（50.676±0.294）%（n＝5），RSD＝0.519%，相对误差为（2.91%～4.03%）＜5%，表明模型有效。与其他薯类的α－淀粉酶酶解相比较，葡萄糖释放率较低，其原因是酶解前未对淀粉进行糊化处理，另一方面与淀粉分子中直链淀粉与支链淀粉的比例、颗粒大小、形状、结晶结构和结晶度等有关［21］。

表2 Box－Benhnken试验设计表及结果

表3 回归方程方差分析表

2.3 Lineweaver－Buck法求解参数

由图2a可知，在淀粉浓度较低时，酶未被底物饱和，反应速率与淀粉浓度呈正比关系，表现为一级反应；随后继续增大淀粉浓度，反应速率不再呈正比增加，表现为混合级反应；当淀粉浓度增至相当高时，淀粉浓度对反应速率影响变小，平衡时达到最大反应速率，表现为零级反应，这表明甘薯淀粉的酶解遵循米氏酶中间络合物学说，可用米氏方程进行拟合。根据式（7），以1／v对 1／［S］作图，见图 2b。求得 Km＝1.742 mg／mL，Vm＝0.143 mg／（mL·min）。α－淀粉酶酶解甘薯淀粉方程为R＝0.996，方程极显著。

图2 淀粉浓度与反应速率的关系

表4 Wilkinson统计法求估算解

表5 Wilkinson法精校解

2.4 Wilkinson统计法求解参数

2.4.1 最小二乘法求估算解

由表4可知，Δ＝αε－γδ＝0．000 000 007 95，式中分别为最大反应速度和米氏常数估算值。

2.4.2 泰勒展开式求精校解

由表5知，Δ′＝α′β′－γ′2＝0．000 011，b1＝（β′δ′－γ′ε′）／Δ′＝1．05；b2＝（α′ε′－γ′δ′）／Δ′＝0．133。得精确解；式中b1和b2分别为 Vm和 Km计算过程中修正常数。

2.4.3 Lineweaver－Buck法和Wilkinson统计法的比较

由表6可知，Lineweaver－Buck法和 Wilkinson统计法计算得到的Vm和Km有一定的差别。这是因为前者的试验点过分集中在直线左下方原点处，在淀粉浓度很低时，其取倒数后误差较大，往往偏离直线较远。［S］适合范围一般为在0.33～2 Km，因此，即使采用最小二乘法线性回归分析，也将影响Km和Vm的准确性［8，10］，但该法方便快速，计算量小。Wilkinson统计法被认为计算结果可靠，但过程冗余且复杂［22］。经上述分析比较，试验最终采用Wilkinson统计法求解结果，即 Vm＝0.107 mg／（mL·min），Km＝0.988 mg／mL。α－淀粉酶酶解甘薯淀粉的动力学方程为

表6 Lineweaver－Buck法和Wilkinson统计法数据比较

2.5 E a计算

在30～50℃范围内，反应速率随温度的增加而增大，以 ln v对1／T（×103）作图，呈直线关系，用阿累尼乌斯（Arrhenius）方程拟合：

式中：R为气体常数 8.31 J／（mol·K）；E a为活化能／kJ·mol；B为积分常数。

将式（11）写成指数形式，K3＝A×exp（－E a／RT），A为前指因子／mg／（mL·min）。回归方程为Y＝8.926－3.849X，R＝0.989，得 E a＝31.986 kJ／mol，A＝7 522.396 mg／（mL·min），R＝0.989，表明Arrhenius方程对该数据的拟合是极显著的。

3 结论

利用响应面法优化α－淀粉酶酶解甘薯淀粉，对酶解动力学进行研究。结果表明：酶解模型为：Y＝35.94＋1.42X1＋1.24X2＋8.61X4＋1.06X5－2.71X1X2－最佳酶解工艺为：酶量0.6 U／mL，时间40min，温度60℃，淀粉质量浓度5 mg／mL和 pH 5.0，验证值为（50.676±0.294）%（n＝5），RSD＝0.519%。在 pH 6.0，50℃条件下，E a＝31.986 kJ／moL，Km＝0.988 mg／mL，Vm＝0.107 mg／（mL·min）。

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Enzymolysis Technology of Sweet Potato Starch by Response Surface Method and Its Kinetic Modeling

Gao Yixia Niu Weiqiang Gao Xiaogang Zhou Xiangjun

（College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001）

To study enzymolysis technology of sweet potato starch and its kinetic modeling，the releasing rate of glucose was taken as an index，and the effects of hydrolysis time，enzyme adding amount，starch concentration，pH and hydrolysis temperature of enzymatic hydrolysis of sweet potato starch have been explored.Single experiment and response surfacemethod have been applied to optimize enzymolysis.At the same time，Michaelis constant（K m），maximum velocity（V m）and corresponding kinetic equation were also calculated by Lineweaver－Burk Plotting and Wilkinson StatisticalMethod.The results showed that the optimal enzymolysis parameterswere 40min，60℃，pH 5.0，enzyme adding amountof0.6 U／mL，and starch concentration of5mg／mL.On this conditions，verification value was（（50.676±0.294）%，n＝5），RSD＝0.519%.At pH 6.0 and 50℃，E a＝31.986 kJ／moL，Kmand Vmwere 0.988 mg／mL and 0.107 mg／（mL·min）respectively.

sweet potato starch，enzymatic hydrolysis，kinetic，response surfacemethod

TS201.1

A

1003－0174（2015）06－0043－06

天水师范学院“青蓝”工程人才基金（TS201406）

2014－01－21

高义霞，女，1982年出生，硕士，食品化学

周向军，男，1980年出生，讲师，食品酶学