补肾安胎冲剂对复发性自然流产小鼠蜕膜组织超微结构的影响

补肾安胎冲剂对复发性自然流产小鼠蜕膜组织超微结构的影响

李伟莉1，杨璇2，李肖凤1

(1.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥230031；2.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的观察补肾安胎冲剂对复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)小鼠蜕膜组织血管、细胞形态及血管内皮细胞超微结构的影响。方法采用DBA/2×CBA小鼠，按照Clark经典方法复制RSA小鼠模型。按妊娠顺序将小鼠随机分为正常妊娠组，模型组，西药组，补肾安胎冲剂高、中、低剂量组，每组10只，分别进行药物干预。光镜下观察蜕膜组织的血管和细胞形态，电镜下观察血管内皮细胞超微结构。结果光镜下见模型组血管数量减少，蜕膜细胞胞浆明显水肿，部分核消失，细胞核固缩；补肾安胎冲剂高剂量组血管丰富且管壁完整，由多个血管内皮细胞环绕而成，小部分蜕膜细胞水肿，细胞核基本无坏死；补肾安胎冲剂中、低剂量组血管数量少于补肾安胎冲剂高剂量组，血管内皮细胞排列不整齐，部分蜕膜细胞胞浆水肿，空泡变，少数细胞核消失。电镜下见模型组血管壁不完整，血管内皮细胞结构不完整，细胞核呈梭形，粗面内质网、核糖体减少，部分线粒体已破坏；补肾安胎冲剂高剂量组血管壁完整，血管内皮细胞结构完整，核膜完整；胞浆中可见丰富粗面内质网及核糖体，线粒体结构完整、无肿胀变性，染色质分布均匀；补肾安胎冲剂中、低剂量组血管壁完整，部分血管内皮细胞肿胀，核膜完整，胞浆中粗面内质网扩张，核糖体轻度减少，部分线粒体肿胀、空泡变。结论RSA模型小鼠存在母胎界面血管生成的障碍，补肾安胎冲剂可以修复RSA小鼠蜕膜组织中破坏的细胞结构，改善血管生成和细胞器完整度，发挥安胎作用。

[关键词]补肾安胎冲剂；复发性自然流产；蜕膜组织；超微结构

[中图分类号]R714.21[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2015.05.020

基金项目：国家自然科学

作者简介：李伟莉(1958-)，女，主任医师，硕士研究生导师

收稿日期：(2015-01-29；编辑：曹健)

复发性自然流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指同一性伴侣连续发生3次或3次以上的自然流产[1]，发病率约占育龄夫妇的1%～5%[2]。引起RSA的原因复杂，除染色体、内分泌、感染、免疫因素及内生殖器官解剖异常外，仍有60%~70%的患者病因不明[3]。目前相关研究认为，自然流产多继之于胚胎停止发育或死胎，血管生成障碍在RSA中的作用越来越受到重视，胎盘健康的血管网络对其正常的血液循环及胚胎发育相当重要。本研究通过观察RSA小鼠蜕膜组织形态学、超微结构，探讨补肾安胎冲剂对RSA小鼠母胎界面血管生成的作用。

1　材料

1.1实验动物选用CBA/J小鼠(雌性60只，未产，鼠龄6～7周龄)、DBA/2小鼠(雄性25只，鼠龄6～7周龄)及BALB/c小鼠(雄性5只，鼠龄6～7周龄)，均由北京华阜康生物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2009-0004。22～25 ℃下饲养，自由饮水、进食，实验开始前先适应性饲养1周。

1.2药物及试剂补肾安胎冲剂(由菟丝子、桑寄生、续断、太子参、白术、白芍、黄芩、熟地黄、苎麻根、旱莲草等组成，每袋10 g)，由安徽中医药大学第一附属医院制剂室提供，皖药制字：BZ20080017；黄体酮(每粒50 mg，共20粒，批号 120638)：浙江仙琚制药股份有限公司生产；柠檬酸铅(编号 S178800)：北京达昱科仪公司；环氧丙烷(批号 T20100610)：国药集团化学试剂有限公司；醋酸双氧铀(编号 1180124)：美国SPI公司；无水乙醇(批号 131108)：江苏省无锡市展望化工试剂公司；环氧树脂：美国；中性树胶：购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3主要仪器石蜡切片机(型号：2235)：德国莱卡；-80 ℃超低温冰箱(型号：DW70-120)：日本Sanyo公司；自动包埋机(型号：TB-718)：德国莱卡；病理切片机(型号：RM2135)：德国莱卡；恒温摊片烤片机(型号：TK-218)：德国莱卡；超薄切片机(型号：LKB-NOVA)：瑞典；台式电热恒温培养箱(型号：HH.B11.260-TBS)：上海跃进医疗器械厂；透射电镜(型号：JEM-1230)：日本；显微图像分析系统(BX51荧光显微镜，DP70数码摄像装置，JD形态分析系统)：日本OLYMPUS。

2　方法

2.1动物模型复制、分组与给药采用具有隐性、反复性和父系特异性特征的DBA/2×CBA小鼠，按照Clark经典方法复制RSA模型[4]。雌性CBA/J小鼠68只，雄性DBA/2小鼠27只，雄性BALB/c小鼠7只，适应性喂养1周后，每晚将雌性CBA/J小鼠分别与雄性DBA/2及BALB/c小鼠按2∶1合笼交配，次日清晨观察雌性小鼠阴道栓并进行阴道涂片，以阴道涂片出现大量精子并出现阴道口大开及阴道栓作为妊娠第1天。分别复制RSA模型(CBA/J×DBA/2)50只和正常妊娠模型(CBA/J×BALB/c)10只。按妊娠顺序随机分为正常妊娠组，模型组，西药(黄体酮26 mg/kg)组，补肾安胎冲剂高剂量(35.1 g/kg)、中剂量(11.7 g/kg)、低剂量(3.9 g/kg)组，每组10只。

在妊娠第1天至第15天，每天上午每只小鼠按20 mL/kg灌胃。西药组和补肾安胎冲剂各剂量组分别以相应药物灌胃，模型组和正常妊娠组灌服蒸馏水。

2.2标本收集所有雌鼠于模型复制24 h后，即妊娠第16天，处死小鼠并完整分离蜕膜组织，用无菌生理盐水洗净血迹，取出标本在4%多聚甲醛溶液内固定24 h，水洗，固定，脱水，包埋，切片厚度固定在4 μm，经苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色后用BX51荧光显微镜观察。取1 cm3组织若干块，立刻固定到2.5%戊二醛溶液中6~12 h，放入磷酸盐缓冲液中1~6 h，1%锇酸溶液固定1~2 h，处理后包埋，切成厚70 nm的切片，电子染色(铅、铀染色)，JEM-1230型透射电镜观察，用数码相机记录图像。

3　结果

3.1各组小鼠蜕膜组织血管形态比较正常妊娠组：蜕膜组织血管丰富，管壁完整，蜕膜细胞呈多边形，相互嵌紧排列，胞质丰富，染色淡，核呈卵圆形，位于中央，染色淡蓝，核仁大而明显(见图1A)。模型组：光镜下见血管数量明显减少，大部分蜕膜细胞胞浆明显水肿，部分核消失，细胞核固缩(见图1B)。西药组：血管较丰富、管壁完整，由多个血管内皮细胞环绕而成，少数部分蜕膜细胞胞浆水肿，空泡变，少数细胞核消失(见图1C)。补肾安胎冲剂高剂量组：血管丰富且管壁完整，由多个血管内皮细胞环绕而成，小部分蜕膜细胞水肿，细胞核基本无坏死(见图1D)。补肾安胎冲剂中剂量组：血管较多，血管内皮细胞排列不整齐，部分蜕膜细胞胞浆水肿，空泡变，少数细胞核消失(见图1E)。补肾安胎冲剂低剂量组：血管数量减少，部分蜕膜细胞胞浆水肿，细胞空泡变，少数细胞核消失(见图1F)。

注：A.正常妊娠组；B模型组；C.西药组；D.补肾安胎冲剂高剂量组；E. 补肾安胎冲剂中剂量组；F. 补肾安胎冲剂低剂量组。

图1各组小鼠蜕膜组织形态变化(HE染色，10×40倍)

3.2各组小鼠蜕膜组织血管内皮细胞超微结构比较正常妊娠组：血管壁完整，由单个或多个血管内皮细胞环绕而成，血管内皮细胞结构完整，细胞膜向腔面突起，核膜完整；胞浆中可见丰富粗面内质网及核糖体；线粒体无肿胀变性，嵴突完整；染色质分布均匀(见图2A)。模型组：血管壁不完整，血管内皮细胞结构不完整，细胞核呈梭形，核内染色质边聚；粗面内质网破坏、减少；核糖体减少；大部分线粒体肿胀变性，呈空泡变化，部分线粒体已破坏(见图2B)。西药组：血管壁完整，血管内皮细胞呈长梭形，血管内皮细胞结构完整，核膜完整，细胞间隙稍增宽；胞浆中可见丰富粗面内质网及核糖体；线粒体肿胀变性，呈椭圆形；染色质分布均匀(见图2C)。补肾安胎冲剂高剂量组：血管壁完整，血管内皮细胞呈长梭形，血管内皮细胞结构完整，细胞膜向腔面突起，核膜完整；胞浆中可见丰富粗面内质网及核糖体；线粒体结构完整，圆形或椭圆形，线粒体无肿胀变性；染色质分布均匀；血管腔内可见红细胞(见图2D)。补肾安胎冲剂中剂量组：血管壁完整，血管内皮细胞轻度肿胀，染色质边聚，核膜完整，细胞间隙增宽；胞浆中粗面内质网扩张；核糖体轻度减少；部分线粒体肿胀变性，呈空泡样变化；血管腔内可见红细胞(见图2E)。补肾安胎冲剂低剂量组：血管壁完整，血管内皮细胞明显肿胀，核内染色质明显边聚，核膜完整；胞浆中粗面内质网部分扩张；核糖体部分减少；部分线粒体肿胀，呈空泡样变化(见图2F)。

注：A.正常妊娠组；B模型组；C.西药组；D. 补肾安胎冲剂高剂量组；E. 补肾安胎冲剂中剂量组；F.补肾安胎冲剂低剂量组。

图2各组小鼠蜕膜组织血管内皮细胞的

超微结构(×12 000倍)

4　讨论

血管生成是体内一种非常重要的过程，在包括再生、创伤愈合、肿瘤生长和转移等在内的许多生理和病理现象中都涉及到这一过程[5]。成功妊娠的维持需要依靠滋养细胞健康的生长，进入母体子宫，侵入子宫螺旋小动脉，取代血管内皮、肌层，即完成血管重铸，从而实现母儿之间的营养交换[6]。一旦母胎界面血管发生生成障碍，可能导致流产发生。

补肾安胎冲剂以补肾健脾为治疗RSA的基本大法，而此法具有防治流产的确切疗效[7]。中医学认为，胞脉为隶属于胞宫的血脉，包括子宫内膜的螺旋小动脉等[8]，胚孕既成，冲任汇聚精血于胞脉以供养胚胎，与妊娠期母胎界面血管生成的作用有相似之处。中医理论中虽然没有直接提出血管生成的概念，但血管概念包括在“脉”“血脉”“络脉”等含义中[9]。中医学认为，肾藏精而主生殖，冲为血海，任主胞胎，冲任二脉根于肾，故曰“胞脉系于肾”，肾虚则冲任随之失摄而滑胎。脾为后天之本，生血而统血，即可充养肾精，助肾之系胞脉功能之发挥，又能通过经络输注营血于胞宫，濡养胞胎。前期研究显示，补肾安胎冲剂能有效提高RSA小鼠血管内皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子受体2的表达，可能改善蜕膜血管的形成，促进胚胎发育，从而降低流产率[10]。

本实验结果显示，模型组较正常妊娠组血管数量明显减少，血管完整度明显降低，蜕膜细胞结构破坏明显，胞浆明显水肿，部分细胞核消失；电镜下见血管壁、血管内皮细胞包膜结构不完整，细胞核呈梭形，核内染色质边聚，细胞器明显受损，粗面内质网及核糖体破坏、减少，部分线粒体破坏。说明RSA存在母胎界面血管生成的障碍。补肾安胎冲剂高剂量组蜕膜细胞结构基本完整。补肾安胎冲剂中、低剂量组血管数量及管壁完整度较补肾安胎冲剂高剂量组稍低，但与模型组比较有明显改善；电镜下见补肾安胎冲剂高剂量组血管内皮细胞包膜完整，核膜完整，细胞器完整。补肾安胎冲剂中、低剂量组血管管壁完整，核膜完整，血管内皮细胞肿胀，胞浆中粗面内质网部分扩张，部分核糖体减少，部分线粒体肿胀空泡变。由此可知，补肾安胎冲剂各剂量组小鼠蜕膜组织血管壁、血管内皮细胞包膜、核膜的完整度，细胞器的数量及完整度明显优于模型组。提示补肾安胎冲剂可以修复RSA小鼠蜕膜组织中破坏的细胞结构，改善血管生成和细胞器完整度，促进母胎界面的血管生成。

补肾安胎冲剂由菟丝子、桑寄生、续断、黄芪、白芍、黄芩等药物组成。现代药理研究表明，黄芪能明显促进内皮细胞增殖、细胞迁移、小管形成，具有显著的促进体外血管新生作用，其机制可能是通过增加血管内皮生长因子的表达而实现的[11]。桑寄生叶提取物槲皮素能抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖及迁移[12]。白芍在免疫调节、抗炎和保护内皮细胞方面有很好的疗效[13]。江雁等[14]研究表明，白芍可抑制缩宫素诱导的子宫平滑肌收缩。马红霞等[15]认为，菟丝子总黄酮使流产大鼠的胎盘、蜕膜病理结构发生良性逆转，通过降低孕鼠的流产率来达到保胎目的，菟丝子总黄酮可能通过改变某种病理状态，进而改善血管的形成，延续妊娠过程。

本研究中RSA模型组血管生成异常，其蜕膜血管超微结构改变，而补肾安胎冲剂各剂量组血管数量及管壁完整度，细胞器数量及其结构完整度均较模型组明显改善，说明中药有改善母胎界面血管生成的作用。补肾安胎冲剂对RSA小鼠具有一定的防治作用，其机制可能与改善小鼠母胎界面血管生成有关。

参考文献：

[1]谢幸，苟文丽.妇产科学[M].8版.北京:人民卫生出版社，2013:49.

[2]Kuon RJ，Wallwiener LM，Germeyer A，et al.Establishment of a standardized immunological diagnostic procedure in RM patients[J].Reprod Immunol，2012，94(1):55.

[3]邵岚，王会茹，杜丽荣.反复流产患者绒毛及蜕膜组织中血管内皮生长因子的表达[J].河北医药，2009，31(9):1096.

[4]Clark DA，McDermott M，Sczewzuk MR.Impairment of host-versus-graft reaction in pregnant mice. Ⅱ. Selective suppression of cytotoxic cell generation correlates with soluble suppressor activity and successful allogeneic pregnancy[J].Cell Immunol，1980，52(1):106-118.

[5]王珺，马志红，刘彩霞，等.正常及复发性流产绒毛组织中血管生成相关基因的表达[J].生殖与避孕，2009，29(2):79-83.

[6]李艳萍，谌兵来，曾文洁，等.整合素β1在早孕流产绒毛组织中的表达[J].中华妇产科杂志，1999，34(4):245.

[7]罗颂平.中医妇科学[M].北京：高等教育出版社，2008：9.

[8]李伟莉，胡瑞华.中西医综合疗法对复发性流产患者血清VEGF、sFlt-1的影响[J].安徽中医学院学报，2013，32(1):11-12.

[9]杨嘉慧，宋莹莹，陈姣洁.促血管新生健黄体功能的中医理法探析[J].河南中医，2012，32(4):514.

[10]熊程俏，李伟莉.反复自然流产小鼠蜕膜VEGF、VEGFR2的表达及中药干预研究[J].中医药临床杂志，2013，24(2):625-626.

[11]张翳，胡光，洪思佳. 黄芪提取物对人脐静脉内皮细胞的促血管新生作用[J].中药药理与临床，2007，23(2):34-36.

[12]孔建名.红花桑寄生叶提取物槲皮素对大鼠血管平滑肌细胞增殖及迁移能力的影响[J].中国中医药科技，2014，21(2):159.

[13]李文亮，黄山君，王瑞.中药白芍的药理作用和质量控制研究进展[J].药学服务与研究，2012，12(2):118-122.

[14]江雁，张凌，熊贤兵，等.白芍不同炮制品对原发性痛经药效的比较研究[J].时珍国医国药，2011，22(6):1317.

[15]马红霞，尤昭玲，王小云.菟丝子总黄酮对大鼠流产模型母胎界面Fas/FasL、PCNA、HB-EGF表达的影响[J].中药材，2008，31(11):1706-1709.

Effects of Granules for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage on Ultrastructure of Decidual Tissue in Mice with Recurrent Spontaneous Abortion

LIWei-li1,YANGXuan2,LIXiao-feng1

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031,China; 2.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

Abstract[] ObjectiveTo investigate the effects of granules for tonifying the kidney and preventing miscarriage (GTKPM) on the blood vessels, cell morphology, and ultrastructure of vascular endothelial cells (VECs) of the decidual tissue in mice with recurrent spontaneous abortion (RSA). MethodsDBA/2×CBA mice were used to induce the mouse model of RSA by the classic Clark method. A total of 50 RSA model mice (CBA/J×DBA/2) were prepared, and 10 normal pregnancy mice (CBA/J×BALB/c) were prepared. The RSA model mice were randomly divided into model group, Western medicine group, high-dose GTKPM group, middle-dose GTKPM group, and low-dose GTKPM group (n=10 for each group). And they received respective interventions. The changes in blood vessels and cell morphology of decidual tissue were observed under a light microscope, and the changes in ultrastructure of VECs were observed under an electron microscope. ResultsUnder the light microscope, reduced number of blood vessels, obvious decidual cell cytoplasm edema, partial nuclear disappearance, and nuclear pyknosis in some decidual cells were observed in the model group; in the high-dose GTKPM group, the rich blood vessels were composed of many VECs and the vascular wall was integral, edema appeared in some decidual cells, and there were few necrotic nuclei; the middle- and low-dose GTKPM groups had few blood vessels than the high-dose GTKPM group, and in the two groups VECs were in disordered arrangement, edema and vacuolization of cytoplasm appeared in some decidual cells, and some nuclei disappeared. Under the electron microscope, in the model group, the vascular wall was incomplete, the structure of VECs was incomplete, nuclei were spindle-shaped, rough endoplasmic reticulums and ribosomes decreased, and some mitochondria were destroyed; in the high-dose GTKPM group, the vascular wall was integral, the structure of VECs andnuclearmembranewerecomplete,therewererichroughendoplasmicreticulumsandribosomes,the