老龄帕金森病模型小鼠氧化应激相关基因的表达差异

马晓伟，张忠霞，王彦永，李晓丽，王铭维

老龄帕金森病模型小鼠氧化应激相关基因的表达差异

马晓伟，张忠霞，王彦永，李晓丽，王铭维

目的探讨老龄帕金森病（PD）模型小鼠行为学改变及黑质纹状体系统氧化应激相关基因的表达差异。方法

老龄；帕金森病；氧化应激；SAMP8；MPTP

1 材料与方法

1.1 实验动物SAMP8小鼠，雌性，10月龄，共16只，26～30 g，清洁级，由香港中文大学解剖学系惠赠。

1.2 主要试剂与仪器MPTP（美国Sigma公司）；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）；RNeasy Mini Kit；RT2 First Strand Kit；RT2 SYBR Green Master Mix

（美国QIAGEN公司）；Real-time PCR Array（Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense；PAMM-065A；美国SABiosciences公司）；A7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；Nanodrop ND-1000紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；5417R超低温离心机（德国eppendorf公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组与给药 按随机数字表法将小鼠随机分为生理盐水对照组（8只）和模型组（8只）。模型组小鼠背部皮下注射MPTP，连续注射4次，每次14 mg／kg，每次间隔2 h。对照组每次均注射等体积无菌生理盐水。于第1次注射72 h进行行为学测试后处死。

1.3.2 行为学检测 用药后72 h对两组小鼠进行行为学测试，采用悬尾实验检测其运动功能。实验方法同文献［6］描述。实验在隔音、安静的房间进行。将小鼠倒置悬挂于实验箱中（长×宽×高为30 cm×25 cm×25 cm，悬挂鼠尾的吊钩距离鼠尾15 mm，通过一连接装置与鼠尾相连），与实验箱连接的电脑分析系统记录5 min内小鼠的静止时间。

本算法共实现高压开关绝缘3种状态的识别,分别为正常态,电晕态和高压放电态[11]。设G1为电晕态的语料,其中包含C11～C1J1共J1条语料,将每条语料分帧,则电晕态共有P1=J1×MJ1帧(MJ1为每条语料的帧数);然后,对每帧语料训练得到GMM模型,可得对应的GMM参数。同理,其他状态的GMM参数也可以得到。这些参数在后续的识别过程中用于识别高压开关柜正常态,电晕态和高压放电态3种状态。

1.3.3 DA水平的检测 各组取4只小鼠处死，冰上迅速剥离出中脑黑质部分，加入遇冷的高氯酸进行匀浆，低温离心机中4℃离心30 min，10 000 r／min，取上清液，采用高效液相-电化学法（HPLCECD）检测DA含量。电化学检测器的工作电压为0.7 V，进样量为20 μl，流速为0.6 ml／min。

1.3.4 PCR Array检测 氧化应激和抗氧化PCR芯片共有84个基因，包括抗氧化基因、ROS代谢基因和氧运载基因。首先将小鼠迅速断头取脑，在冰上剥离出纹状体组织，电子天平称重后即刻使用RNeasy Mini Kit提取纹状体组织的RNA，微量分光光度计测定RNA浓度及质量；使用RT2 First Strand Kit将1 000 ng RNA逆转录为单链cDNA；使用小鼠氧化应激及抗氧化聚合酶链反应产物序列分析（Mouse Oxidative Stress and Antioxidant Defense RT2 Profiler PCR Array），检测模型组及对照组老龄SAMP8小鼠氧化应激相关基因的差异表达。PCR Array结果使用SABiosciences PCR Array数据分析Excel模板进行分析，上调或下调水平2倍及以上的基因为有意义。

1.4 统计学处理采用SPSS 13.0软件进行分析，实验数据以±s表示，两组间比较采用t检验。

2 结果

2.1 悬尾实验结果与对照组相比，模型组小鼠悬挂的静止时间明显延长，差异有统计学意义（t＝11.27，P＜0.01）。见图1。

2.2 DA水平的改变与对照组相比，模型组小鼠在注射MPTP后72 h DA水平下降了81.67%，差异有统计学意义（t＝16.86，P＜0.01）。见图2。

2.3 氧化应激相关基因的表达PCR Array结果显示：与对照组相比，模型组小鼠嗜酸粒细胞过氧化物酶（eosinophil peroxidase，EPX）、生长因子受体结合蛋白2相关结合蛋白1（growth factor receptor bound protein 2-associated protein 1，GAB1）、谷胱甘肽过氧化物酶3、6、8（glutathione peroxidase 3，6，8，GPX3，6，8）、乳酸过氧化物酶（lactoperoxidase，LPO）、肌红蛋白（myoglobin，MB）、膜蛋白棕榈酰化4（membrane protein palmitoylated 4，MPP4）、神经珠蛋白（neuroglobin，NGB）、核氧化还原蛋白（nucleoredoxin，NXN）、过氧化物氧化还原酶1（peroxiredoxin 1，PRDX1）、溶质运载蛋白家族41成员3（solute carrier family 41 member3，SLC41A3）12种基因分别依次下调4.32、2.01、3.37、2.74、2.68、2.85、3.44、2.38、2.23、2.32、4.29及2.11倍；可诱导型一氧化氮合酶2（inducible Nitric oxide synthase 2，iNOS2）、烟酞胺腺嘌呤二核苷酸磷酸环氧化酶（nicotinamideadeninedinucleotidephosphate-oxidase，NOX）及环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）基因分别上调2.57、2.01及8.61倍。见表1。

3 讨论

MPTP是广泛用于PD研究的神经毒素，因其高亲脂性可以迅速通过血脑屏障进入大脑，之后在单胺氧化酶B的作用下于神经胶质细胞中转变为MPP＋，在细胞膜上多巴胺转运体（DAT）的作用下进入DA能神经元，之后聚集在突触小泡中，抑制线粒体内电子呼吸链的传递，损伤复合体Ⅰ的功能，导致中脑ATP水平下降，细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）与活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）产生增多，引起氧化应激的发生［7］与DA能神经元的损伤。

本实验在应用MPTP的基础上，选用生长周期快并具有老化特征的10月龄SAMP8小鼠用于老龄PD模型的制作，结合毒素与衰老两种致病因素，对于PD病理机制的研究比使用传统小鼠模拟PD更具优势。为了明确PD模型是否制作成功，本实验在给模型组小鼠注射MPTP之后，检测其中脑黑质的DA含量并进行悬尾实验。悬尾实验是一种经典而又能快速评价药物毒性或药效的方法，研究者在MPTP干预的PD模型鼠中，通过评测其悬尾实验中静止的持续时间来反映小鼠黑质纹状体系统DA能神经元的退行性变，认为静止时间的延长是PD模型小鼠运动障碍的结果［6-8］。本实验结果发现其中脑的DA含量下降81.67%，悬尾实验中静止时间增加了85.7%，证实老龄SAMP8对于MPTP的易感性，复制老龄PD模型成功。

PCR Array结果显示，与氧化应激相关的基因在mRNA水平发生改变。与对照组相比，模型组共有12种基因的改变超过2倍，其中3种上调，9种下调。ROS与RNS是体内主要的两种自由基。NOX是生成ROS的主要酶体［9］，iNOS2可催化合成RNS及NO，二者在模型组小鼠分别上调了2.01倍和2.57倍；COX-2通过产生活性氧将体内的DA氧化为有活性的DA-醌类，使α-突触核蛋白聚集，之后导致PD的病理性标志物路易小体的形成［10］，临床已使用其抑制剂治疗PD［11］，本结果显示其水平显著上调。

氧化应激反应增强的同时，抗氧化防御体系功能下降。GPX是生物体内重要的抗氧化酶之一，通过促进过氧化氢及脂质过氧化物的分解，保护细胞膜的结构及功能［12］。本研究中GPX3、6、8分别下降了3.37倍、2.74倍和2.68倍，反映出机体抗氧化应激能力的下降。PRDX1通过硫氧还蛋白还原过氧化物或超氧化物，消除代谢产生的过氧化物［13］，结果显示其表达下调了4.29倍。NXN在氧化应激状态下可与其相结合的DvI蛋白解离，激活下游的Wnt信号通路影响细胞状态与功能。LPO可抑制脂质过氧化，清除羟基自由基并具有抗菌活性［14］。此外，还有肌红蛋白、促红细胞生成素、神经珠蛋白等几种基因表达均下调2倍以上。

综上所述，本研究显示，老龄PD模型小鼠在急性损伤后72 h，氧化应激相关基因发生差异性改变，促氧化反应的基因上调，抗氧化基因下调，氧化应激系统与抗氧化应激体系二者的失衡导致机体病理生理的改变。相关基因的明确为以后临床寻找辅助诊断指标与治疗靶点提供依据。

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Oxidative stress related gene expression difference in aging Parkinson’s disease model mice

Ma Xiaowei，Zhang Zhongxia，Wang Yanyong，et al
（Dept of Neurology，The First Hospital of Hebei Medical University，Brain Aging and Cognitive Neuroscience Laboratory，Shijiazhuang 050031）

ObjectiveTo explore the behavior changes and oxidative stress related gene expression difference in nigro-striatal system of aging Parkinson’s disease model mice.MethodsSenescence-accelerated mouse prone 8（SAMP8）aged 10-month old in sum of 16 were randomly divided into control group and model group.Acute injury was made by subcutaneous injections of 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine（MPTP）to mice in model group，while a corresponding volume of saline was given to the control.72 hours after injection，all the animals were tested by the behavioral test.Dopamine（DA）contents in nigro were measured by a high performance liquid chromatography with electochemical detector，and the oxidative stress related genes expression was detected by polymerase chain reaction array（PCR Array）.ResultsCompared with the control group，the DA levels and behavioral performance were both remarkably decreased in model group（P＜0.01）.Cyclooxygenase-2，inducible Nitric oxide synthase 2，reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）oxidase were up-regulated，while 9 genes such as glutathione peroxidase 3，6，8 were all down-regulated significantly（fold change＞2）.ConclusionUp-or down-regulation of oxidative stress related genes may result in the occurence of oxidative stress in aging PD model mice.

aging；Parkinson′s disease；oxidative stress；SAMP8；MPTP

R 742.5

1000－1492（2015）01－0029－04

2014－09－24接收

河北省医学科学研究重点课题计划（编号：20110302、20130272）

河北医科大学第一医院神经内科，河北省脑老化与认知神经科学实验室，石家庄 050031

马晓伟，女，硕士，副主任医师；王铭维，女，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：wmw＠hebmu.edu.cn

10月龄快速老化P8系（SAMP8）小鼠16只，随机均分为对照组和模型组。模型组小鼠背部皮下注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）制成急性损伤模型，对照组小鼠给予同量生理盐水。给药后72 h进行行为学测试，高效液相色谱法检测黑质多巴胺（DA）含量，PCR Array检测其纹状体氧化应激相关基因的表达。结果 与对照组相比，模型组小鼠DA水平下降，行为学成绩下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；环氧化酶-2、可诱导型一氧化氮合酶2、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶基因表达上调；而谷胱甘肽过氧化物酶3、6、8等9种基因明显下调（改变倍数＞2）。结论 老龄PD模型小鼠氧化应激相关的基因发生上调或下调，导致氧化应激反应的发生。