TGF-β诱导肿瘤细胞上皮-间充质转化的调节及信号转导机制研究进展

任周新，沈俊岭，李 亚综述 余海滨审校

综述

TGF-β诱导肿瘤细胞上皮-间充质转化的调节及信号转导机制研究进展

任周新1，2，沈俊岭1，2，李 亚1综述 余海滨1审校

上皮－间充质转化（EMT）是源于上皮细胞的恶性肿瘤细胞获得迁徙和侵袭能力的重要生物学过程。恶性上皮性肿瘤细胞和基质细胞分泌的转化生长因子β（TGF-β）诱导和促进了肿瘤细胞的EMT过程。有研究表明TGF-β借助于Smad依赖性或非Smad依赖性信号转导通路，诱导或抑制EMT过程关键基因的表达；细胞外及细胞膜的多种因子则对上述信号转导过程产生调节作用。结果提示，在TGF-β诱导的肿瘤细胞的EMT过程，涉及一个复杂而精细的信号转导调控网络。

转化生长因子β；上皮－间充质转化；信号转导

上皮－间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程，是肿瘤侵袭和转移过程的重要启动步骤；转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是肿瘤细胞EMT过程的重要诱导因子。在TGF-β的介导下，上皮肿瘤细胞获得了更多的间充质的表型、丧失了上皮细胞的表型，导致侵袭和迁移能力的提升［1］，从而加速了肿瘤的扩散和发展，见图1。近年来针对TGF-β诱导的EMT过程中的信号转导和调节机制进行了大量的研究，取得了一定的进展，笔者就这些研究结果作一综述。

1 TGF-β信号通路

TGF-β超家族包括TGF-β、活化素（activin）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、多种生长与分化因子（growth and differentiation factors，GDFs）等成分，这些成分对细胞的生长、生存、分化和迁移具有调节作用；在胚胎形成和成年组织的局部内环境稳态的维持中，TGF-β也具有重要的作用［2］。TGF-β与某些疾病之间存在密切的联系，如自身免疫性疾病、心血管疾病和肿瘤［3］。在肿瘤形成的早期阶段，TGF-β通过抑制肿瘤细胞的生长以及促进细胞的凋亡产生抑制效应；但在随后肿瘤的进展阶段，却促进肿瘤的发展，这种作用与其诱导肿瘤细胞的EMT有关。例如，上皮肿瘤细胞获得了更多的间充质的表型并丧失了上皮细胞的表型，导致侵袭和迁移能力的增强［1］，加速了肿瘤的扩散和发展。此外，TGF-β的促肿瘤形成作用还涉及实体瘤的基质细胞，机制涉及对血管形成的刺激、免疫监视的抑制以及炎症细胞的募集。

TGF-β与细胞膜Ⅰ型和Ⅱ型serine／threonine激酶受体（TGF-βRⅠ／Ⅱ）结合，改变TGF-βRⅠ／Ⅱ的结构，磷酸化并激活胞质内的TGF-βRⅠ激酶，催化受体活化型Smads（如Smad2、Smad3）并使其活化，然后与Smad-4结合形成复合物，进入并积聚于细胞核，在细胞核与其他的转化因子结合，调节特定基因的表达。此外，该TGF-β受体活化后，还能磷酸化其他信号通路蛋白，影响其他信号的转导。如磷酸化Shc的tyrosine活化Ras／MAP-激酶通路；磷酸化Par6的tyrosine导致上皮极性复合物失活。此外，该TGF-β受体复合物形成一个募集泛素激酶TRAF6的信号支架，后者启动Jun N-terminal激酶和P38 MAP-激酶的信号瀑布［4］。

另外，TGF-β还有非-Smad信号转导通路，涉及phosphatidylinositol 3’-激酶，the tyrosine kinase Src和小GTPase Rho。另外，TGF-βRⅠ也可能被基质金属蛋白酶TACE裂解，该裂解方法依赖于泛素连接酶TRAF6和蛋白激酶C，裂解后的TGF-βRⅠ的细胞内部分被转座到细胞核，调节肿瘤细胞的侵袭能力［5］。

2 TGF-β和肿瘤EMT

肿瘤细胞进入不同的组织，需要经历一系列的迁移过程。如从原位癌突破局部上皮细胞基底膜，侵入周围组织；通过循环系统转移；在特定位点从循环系统中转移到新的宿主环境。

与肿瘤有关的EMT的实验结果存在某些争议，原因在于EMT过程的短暂、具有可逆转的性质以及较难识别人类肿瘤样本中的正在进行EMT转化的肿瘤细胞。某些研究［3］提示肿瘤的发展过程与EMT有关。EMT是指在特定的生理和病理情况下，具有极性的上皮细胞向间充质细胞转化的现象。EMT现象最早于1982年被发现，研究显示胚胎期和成年期晶状体的上皮细胞在三维胶原凝胶中培养可形成伪足，随后转变为间充质样细胞［6］。目前认为EMT是启动肿瘤转移反应的关键步骤，可参与多种肿瘤（前列腺癌、食管癌及胃癌等）的侵袭、转移过程。

TGF-β是EMT产生的初始诱导者，之后发生了广泛的上皮细胞核的重新编程，产生出progenitorlike特征，细胞之间的连接发生了改变，以至于原本正常的上皮细胞之间的连接变得易于弯曲和可塑，造成细胞从上皮组织的脱离［3］。上述现象是细胞内外一系列结构变化的结果。在细胞内，微丝、微管和中间丝发生了结构变化，而在细胞外，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）也发生了结构改变，这些变化促进了细胞之间形成新的膜连接方式；另外，细胞外基质中的细胞因子、趋化因子等生物活性分子组成和数量也发生了相应的变化。所有这些变化为肿瘤入侵提供了适宜的微环境，而且为肿瘤向周围血管内渗提供了关键步骤。

3 细胞外和细胞膜因子共同调节TGF-β诱导的EMT

沉积于ECM中的静止形式的TGF-β，通过蛋白裂解方式、与基质和细胞膜蛋白的相互作用方式被活化，活化后与受体结合产生信号［7］。如电离辐射能够活化静止状态的TGF-β，诱导乳腺癌肿瘤细胞产生EMT［8］。此外，TGF-β表达的调控、相关受体以及信号介质等，均能够调节肿瘤细胞对TGF-β的反应能力以及EMT反应的强弱。如CCN5蛋白（一种在细胞质与细胞核之间的往来穿梭的蛋白质），在细胞核内，该蛋白与HDAC1连接，抑制TGF-βRⅡ的表达，因此限制了TGF-β信号通路的作用，产生抑制TGF-β诱导EMT的效应［9］。与之相反，具有促进生长作用的同源框转录因子Six1通过转录方式诱导TGF-βRⅠ表达，因此Six1活化具有提高TGF-β诱导EMT的效能［10］。

最近的研究［11］表明：其他类型的蛋白，如SCUBE3，能够与TGF-βRⅡ结合，促进肺癌细胞中的EMT反应并提高癌细胞的侵袭能力。Klotho是一种肾转膜蛋白，当Klotho的细胞外决定区伸出细胞膜时，能够与TGF-βRⅡ结合、阻止信号的转导，抑制EMT反应；Klotho不仅仅拮抗TGF-β，而且拮抗Wnt和胰岛素样生长因子1信号通路。鉴于这两条信号通路直接或间接地促进了EMT，因此，Klotho能够同时阻断多条诱导EMT信号通路，具有较为广泛的作用途径［12］。

与其他研究的广度和深度相比，TGF-β细胞外和细胞膜调节因子的研究较为薄弱，有必要深入开展这方面的研究工作，确认抑制和促进TGF-β的调节因子，了解这些因子的作用机制和效应。然后，从中选择出适宜的研究对象作为药物研究的新靶点，建立一条治疗肿瘤迁徙和扩散新的药物研究途径。

4 TGF-β诱导EMT的信号转导

TGF-β诱导EMT的信号转导涉及一个相互交织、精细调节的蛋白质网络，不仅Smad而且非Smad通路均可诱导EMT的发生，其详细的动力学调节机制正在研究中［13］。

4.1 Smads参与TGF-β诱导的EMT反应

Smads蛋白存在于胞质中，含有高度保守的N端功能域（Mad-Homology domain 1，MH1）和C端功能域（MH2），前者可与DNA的CAGAC序列结合，后者则与转录辅激活蛋白或辅阻遏物相互作用。这两个功能域之间存在一个富含脯氨酸的连接区，含有多个磷酸化位点，属于Smads的负调控区。Smads介导由胞膜受体转导入胞核内的TGF-β信号转导，是细胞内TGF-β信号转导的关键环节。

体内和体外研究［14］显示，R-Smads和Smad4介导TGF-β诱导的EMT反应中的受体的下游信号转导。需要注意的是不同的Smad分子具有不同的作用。例如，特异性地去除Smad3的角化细胞，产生自发性的鳞状细胞癌；另外，对化学性刺激诱发的皮肤肿瘤，去除Smad3后产生抑制肿瘤的保护作用，后者进一步确定Smad3介导了众多的致瘤信号传递［15］。与之相反，角化细胞中去除Smad2，在化学刺激后，加速细胞的癌变［15］；上述产生的Smad2-表达阴性的鳞状癌细胞具有EMT众多标志的病态分化的特性，E-cadherin的表达受到抑制［15］。对于小鼠的皮肤，Smad2保护上皮细胞避免EMT。这些研究表明，对于皮肤细胞，Smad3诱导或促进EMT而Smad2则抑制EMT或维持上皮特征。

与上述的Smad2抗EMT的保护作用相一致，在人类肾上皮细胞中，使Smad2表达沉默或SARA（一种细胞内的接头蛋白，能够促进Smad2连接到TGF-βRⅠ和促进磷酸化过程）沉默，促进EMT的发生［16］。SARA的丢失，通过泛素连接酶Smurf2和蛋白体的降解，促进Smad2的泛素化。WWP2连接酶也能调节R-Smad水平，影响EMT反应［17］。另有研究［18］显示，纤维化肺脏上皮细胞中的EMT依赖于TGF-β受体与integrin α3β1受体之间的相互作用，使磷酸化Smad2-磷酸化β-catenin-转录复合因子活化，在体内和体外产生促EMT作用。

核Smad复合物的生物学效应受到蛋白激酶的影响。JNK1有多种同型异构体，在TGF-β引起的EMT反应中，产生不同的影响。JNK2似乎对TGF-β诱导的EMT有抑制作用，如缺乏JNK2的细胞对TGF-β刺激，表现出强烈的EMT反应［3］；JNK1则显示出促进EMT的效应，如抑制JNK1的表达能够显著减轻多种刺激剂诱导的肺气管上皮细胞的EMT反应［19］。JNK1似乎对带有AP-1家族成员的Smad转录复合物（Jun／Fos）具有催化作用，该复合物作用的目标基因具有重要的促进肿瘤细胞侵袭以及EMT的作用［20］。另外，TGF-β-诱导转移相关蛋白-1（metastasis-associated protein 1，MTA-1）表达，MTA-1与AP-1复合物相互协作，引起FosB的转录［21］。FosB与HDAC2形成复合物抑制多种乳腺细胞表达E-cadherin，介导了EMT过程。

除了蛋白激酶，特异性的sumo-E3连接酶PIAS1也能调节TGF-β诱导的EMT反应。TGF-β下调PIAS1并且减少核抑制蛋白SnoN（一个已知的Smad辅助因子）的sumo化修饰［22］。Sumoylation的不足打破了原有的平衡，最终使SnoN降解，导致TGF-β诱导的Smad复合物能够产生EMT过程所必需的基因调节作用。与之相反，E3泛素连接酶TIF1γ使Smad4泛素化，导致核Smad复合物的破坏，因此产生拮抗TGF-β诱导的EMT的作用［23］。

在肺腺癌A549细胞中，Smad3与HDAC6的相互作用进一步表明Smad3在TGF-β诱导的EMT中具有促进作用［24］。用药物抑制剂或siMRA抑制HDAC6或Smad3均会产生抑制EMT反应的效应。HDAC6使微管中的微管蛋白脱去α-乙酰基，对细胞的迁移产生某种影响，但是，是否HDAC6-Smad3共调节也影响微管的运动或影响EMT的其他表现，这些尚不明确。在A549细胞的EMT过程中，TGF-β能够下调适配器蛋白胰岛素受体底物1（adaptor protein insulin receptor substrate 1，IRS1）［25］。IRS1的过度表达阻断EMT反应，而用RNAi清除IRS1却能显著促进EMT反应，RNAi的作用与提高TGF-β诱导Snail1和Snail2的表达并最终下调E-cadherin的表达有关。其详细的分子机制可能包括某种磷酸酶磷酸化IRS1或某种其他的降解机制，或者同时涉及这两个机制［3］。

4.2 非-Smad的介导TGF-β诱导的EMT的路径

在上皮细胞中，TFG-β通过磷酸化adaptor protein Par6形成了一条信号通路，该通路将TGF-β受体直接与蛋白质的翻译后修饰和调节联系在一起［26］。磷酸化的Par6募集泛素连接酶Smurf1，该酶降解小GTPase RhoA，导致肌动蛋白微丝结构的变化，破坏了细胞间正常的紧密的连接。

受体连接的泛素连接酶TRAF6介导lysine63-依赖的转化生长因子β激活激酶1（TGF-beta-activated kinase 1，TAK1）的多泛素化反应。TRAF6的酶促反应，使MAP-激酶-激酶磷酸化并被激活，随后激活p38MAP激酶和JNK MAP激酶［4］。和TGF-βRⅡ-Par6通路类似，该信号通路也不依赖Smads，参与乳腺上皮细胞的EMT反应［27］。然而，TGFβ受体-TRAF6-TAK1复合物，除了通过MAP激酶途径还可能通过其他的效应器途径，介导了促进EMT的信号转导。例如在初始的间皮细胞里，p38MAP激酶通过抑制TAK1活性和抑制其下游的效应器——即核转录因子-κB（NF-κB）。NF-κB是一种重要的核转录因子，其活化对于TGF-β诱导的EMT过程产生重要的影响［28］。TRAF6不仅泛素化和激活TGF-β信号下游的TAK1，而且也泛素化直接与之连接的TGF-βRⅠ［5］。该泛素化促进TGF-βRⅠ细胞外受体区（ICD）的裂解，该区包括全部的激酶决定区，随后促进裂解后的ICD区运输到细胞核。在核内，TGF-βRⅠICD通过与共激活因子p-300以及包含众多基因的染色质结合，调节转录过程，这些基因对EMT和肿瘤入侵有促进作用，如Snail基因［5］。TGF-βRⅠICD与核的Smad复合物共同作用于靶基因，调节TGF-β诱导的EMT反应。

上述研究结果表明：TGF-β借助于Smad依赖性或非Smad依赖性信号转导通路诱导或抑制EMT过程关键基因的表达；细胞外及细胞膜的多种因子则对上述信号转导过程产生调节作用。提示TGF-β诱导的肿瘤细胞的EMT过程涉及一个复杂而精细的信号转导调控网络。对其中某些关键节点的有效干预可能为抑制肿瘤细胞的侵袭和迁徙提供新的治疗方法。

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R 735.2；R 730.231

1000－1492（2015）

2014－07－23接收

国家自然科学基金（编号：81302921）；河南中医学院第一附属医院临床研究支持项目（编号：2013KJ12）

1河南中医学院第一附属医院，2河南省病毒性疾病中医药防治重点实验室，郑州 450000

任周新，男，高级实验师；余海滨，男，副主任医师，副教授，责任作者，E-mail：yhbzzz＠163.com