NF-κB沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖

潘红杰，范才文，易世江，李 璐，刘建翔，王建红，罗 琴，向 秋

NF-κB沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖

潘红杰1，范才文1，易世江2，李 璐1，刘建翔1，王建红1，罗 琴1，向 秋

目的探讨核因子-κB（NF-κB）沉默对鼻咽癌5-8F细胞的增殖抑制作用。方法构建NF-κB p65沉默重组质粒表达载体pGenesil-1.2-NF-κB和阴性对照重组质粒载体pGenesil-1.2-HK，应用转染试剂将重组质粒表达载体转染人鼻咽癌5-8F细胞，采用Western blot法检测NF-κB p65的表达，采用MTT及流式细胞仪分析细胞增殖和细胞周期。结果NF-κB p65沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖，抑制率为（58.43±1.24）%，与对照组细胞抑制率（0）和阴性对照组细胞抑制率（17.89±4.13）%比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。NF-κB沉默组S期细胞为（42.27±0.39）%，与空白对照组（30.83±1.36）%和阴性对照组（34.88±0.85）%比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 NF-κB p65沉默抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖，其可能是通过S期细胞阻滞起作用。

NF-κB；鼻咽癌；siRNA

核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是Rel／NF-κB家族中的重要转录调节因子。烟草、饮食和环境等多种因素能激活NF-κB［1］。研究［2］显示，在淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌及卵巢癌等组织中均发现活化的NF-κB。沈斌等［3］研究发现，鼻咽癌中NF-κB p65高表达与淋巴结转移、临床分期和不良预后有关。何晓松等［4］发现表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）下调NF-κB p65表达后，鼻咽癌移植瘤对放疗的敏感性增强。抑制NF-κB活性，阻止肿瘤细胞增殖，诱导其凋亡。该研究选取NF-κB基因作为研究靶点，探讨NF-κB p65基因沉默对鼻咽癌5-8F细胞生物学行为的影响，为NF-κB在鼻咽癌中的作用和功能研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂鼻咽癌5-8F细胞系和大肠杆菌JM109均由桂林医学院科学实验中心保种；质粒表达载体pGenesil-1.2购自武汉淅玛生物技术有限公司；高纯度质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；1640培养基购自Gibco公司；转染试剂Effectene Transfection Reagent购自Qiagen公司；DMSO、MTT购自美国Sigma公司；鼠抗人NF-κB p65一抗购自Bioworld公司；小鼠抗人GAPDH一抗、辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗和BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；PVDF膜购自Millipore公司；ECL发光液购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 NF-κB特异性SiRNA质粒表达载体的构建

根据GenBank中人NF-κB p65的表达序列，设计、合成2条NF-κB特异性干扰序列，构建NF-κB特异性沉默重组质粒表达载体（pGenesil-1.2-NF-κB），正义链：5’-ATGGACAGCACATGCGCTGACTGATAGCCTGCGGGAAAGAGTGATCTC-3’；反义链：5’-CCC AAGCTTAAAAAGCAGGCTATCAGTCAGCGCATGGA CAGCACAT-3’。正义链：5’-AATCTCTTGAATTT ACGTTTCTCCTCAATCCGGGTGTTTCGTCCTTTC-3’；反义链：5’-GCGGATCCAAAAACGGATTGAGGAGA AACGTAAATCTCTTGAATT-3’。

同时设计1条阴性对照序列（HK），构建阴性对照重组质粒表达载体（pGenesil-1.2-HK），该序列与人的基因序列无同源性。正义链：5’-CCTCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTA TGAAGTCTTTTTTG-3’，反义链：5’-AGCTCAAAA AAGACTTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATGC GCCTTATGAAGTC-3’，将合成的干扰序列正义链和反义链退火，合成双链DNA干扰片段，将干扰DNA片段亚克隆到pGenesil-1.2质粒表达载体上，构建重组NF-κB p65特异性抑制的质粒表达载体pGenesil-1.2-NF-κB和重组阴性表达质粒载体pGenesil-1.2-HK。

1.3 实验分组及细胞转染

1.3.1 实验分组 实验设空白对照组（未转染载体的5-8F细胞）、阴性对照组（转入pGenesil-1.2-HK质粒表达载体的5-8F细胞）、实验组（转入pGenesil-1.2-NF-κB质粒表达载体的5-8F细胞）。

1.3.2 细胞转染 人鼻咽癌5-8F细胞采用RPMI 1640培养液（含10%小牛血清，100 U／ml青霉素，100 μg／ml链霉素）培养，0.25%胰酶消化细胞，将细胞接种于6孔板，接种密度为5×104／ml，每孔2 ml。细胞融合达60%～80%时，应用Effectene Transfection Reagent转染试剂将构建好的pGenesil-1.2-NF-κB和pGenesil-1.2-HK重组质粒表达载体转入鼻咽癌5-8F细胞，重组质粒终浓度为0.25 μg／ml，然后于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。由于pGenesil-1.2载体表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP），转染48 h后，于倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果。

1.4 Western blot法检测NF-κB p65表达细胞转染48 h后，去上清液，细胞用适量通用蛋白裂解液裂解，置冰上15 min，收集细胞裂解液，4℃、12 000 r／min离心30 min，收集上清液。采用BCA法测定总蛋白浓度。蛋白上样后，采用100 V进行10%SDS-PAGE电泳分离，恒流260 mA，湿转1.5 h将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入NF-κB p65一抗（1：500），70 r／min，2 h；用TBST洗4次，每次8 min，加入辣根过氧化物酶山羊抗小鼠IgG二抗，70 r／min，1.5 h，TBST洗4次，每次8 min，采用ECL发光试剂进行发光，然后进行图像分析。同样操作检测GAPDH表达。

1.5 MTT法检测细胞增殖0.25%胰酶消化细胞，调整细胞密度至2.5×104／ml，接种于96孔板，每孔接种5 000个。每组设3个复孔，细胞转染48 h后，每孔加入MTT（5 mg／ml）20 μl，继续培养4 h。然后吸去上清液，每孔加入200 μl DMSO，振荡10～15 min使结晶充分溶解，用酶标仪（490 nm波长）测定各孔的吸光度值（OD值）。计算细胞生长抑制率（IR）＝［1－（实验组OD值／对照组OD值）］× 100%。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期细胞转染48 h后，PBS洗涤细胞3次，0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，1 000 r／min离心5 min，PBS洗涤2次，加70%预冷的乙醇溶液，－20℃固定过夜，1 000 r／min离心10 min，弃去乙醇，PBS洗涤2次，加入400 μl RNase A，37℃水浴30 min，加入PI染液，避光染色30 min，200～300目筛网过滤，采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 统计学处理实验数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量数据以±s示。多组间均数比较采用（One-Way ANOVA）完全随机的单因素方差分析。

2 结果

2.1 重组表达质粒载体转染细胞判别重组pGenesil-1.2-HK、pGenesil-1.2-NF-κB质粒表达载体带有GFP，转入细胞后，在倒置荧光显微镜下观察呈现绿色荧光。见图1。

2.2 pGenesil-1.2-NF-κB转染抑制5-8F细胞NF-κB p65表达pGenesil-1.2-NF-κB转染鼻咽癌5-8F细胞，NF-κB p65蛋白表达抑制，与对照组和阴性对照组比较，蛋白表达抑制明显。见图2。

2.3 NF-κB沉默对5-8F细胞增殖的影响NF-κB沉默抑制5-8F细胞增殖，抑制率为（58.43± 1.24）%，与空白对照组抑制率（0）和阴性对照组抑制率（17.89±4.13）%比较，差异有统计学意义（F＝1 971.46，P＜0.05）。

2.4 NF-κB沉默对5-8F细胞周期的影响NF-κB沉默，5-8F细胞呈现S期阻滞，S期细胞为（42.27± 0.39）%与对照组（30.83±1.36）%和阴性对照组（34.88±0.85）%比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图3。

表1 流式细胞仪分析细胞周期（48 h）（%，n＝3，±s）

与阴性对照组、空白对照组比较：*P＜0.05

组别G1期F值G2期F值S期F值空白对照59.37±1.309.80±0.6330.83±1.36阴性对照56.13±1.30 33.83 9.00±0.46 39.34 34.88±0.85 110.97实验52.14±0.365.59±0.7342.27±0.39*

3 讨论

鼻咽癌是一种好发于鼻咽黏膜的恶性肿瘤。由于鼻咽癌发病十分隐匿，早期症状和体征不明显，缺乏有效的早期诊断方法，绝大多数病例在就诊时已属中晚期，治疗效果仍不佳，Ⅳ期鼻咽癌患者5年生存率为30%～50%［5］。深入研究鼻咽癌发病的分子机制，寻找新的治疗方法是提高鼻咽癌整体疗效的关键。siRNA技术是将一段与目的基因同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）导入细胞，使mRNA发生特异性的降解，从而实现序列特异性沉默［6］。方法简单易行、快速、有效、序列特异性强等优点，并且导入多种dsRNA可以同时敲除多个基因，细胞转染后几天就可观察到靶向基因沉默后的生物学现象。该研究所用的pGenesil-1.2载体带有GFP，在倒置荧光显微镜下，通过观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，并分析细胞的转染效率，5-8F细胞转染效率为70%～80%。

NF-κB作为一类核转录因子，多以P50／p65二聚体的形式存在［7］。当细胞在非刺激状态下，NF-κB与它的抑制物IκB结合，并以一种静息的形式存在于细胞质，当细胞受到损伤等刺激后，IκB降解，活化的NF-κB释放并转移至细胞核，调节靶基因的转录［8］。许多癌症患者的癌组织中均发现活化的NF-κB，如白血病、淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、肝癌等［9］。资料显示，在肿瘤发展的后期阶段，使用IκB的超级抑制物进行诱导，抑制NF-κB的活化，导致转化的肝细胞发生细胞凋亡，进而阻滞肝细胞癌的进展［10］。该研究通过构建NF-κB p65沉默重组质粒表达载体pGenesil-1.2-NF-κB，观察其转染鼻咽癌细胞后的生物学作用。Western blot检测表明：pGenesil-1.2-NF-κB质粒表达载体转染抑制5-8F细胞NF-κB p65表达，与空白对照组和阴性对照组比较，NF-κB p65蛋白表达明显下降。说明NF-κB p65 siRNA能抑制5-8F中NF-κB p65蛋白的表达。干扰表达载体转染细胞48 h，实验组细胞增殖抑制率为（58.43±1.24）%，明显高于空白对照组抑制率（0）和阴性对照组抑制率（17.89±4.13）%。NF-κB质粒表达干扰载体转染，抑制5-8F细胞增殖，呈现S期阻滞。作者构建的NF-κB特异性干扰质粒表达载体能沉默NF-κB基因，抑制细胞增殖，为鼻咽癌的靶向治疗提供了实验基础。

［1］ Gupta S C，Sundaram C，Reuter S，et al.Inhibiting NF-kappaB activation by small molecules as a therapeutic strategy［J］.Biochim Biophys Acta，2010，29（3）：775－87.

［2］ Kannappan R，Gupta S C，Kim J H，et al.Tocotrienols fight cancer by targeting multiple cell signaling pathways［J］.Genes Nutr， 2011，7（1）：43－52.

［3］ 沈 斌，董 频，英信江，等.ABCG2和NF-κB p65在鼻咽癌中的表达及其意义［J］.临床肿瘤学杂志，2012，17（5）：424－7.

［4］ 何晓松，易世江，凌月福，等.实EGCG抑制NF-κB的表达增强鼻咽癌裸鼠移植瘤对放疗的敏感性［J］.实用医学杂志，2010，26（16）：2905－7.

［5］ 苏胜发.鼻咽癌治疗进展［J］.肿瘤预防与治疗，2010，23（1）：66－70.

［6］ 侯程浩，陶 蓉，史立宏，等.稳定表达siRNA-NUAK1基因95D细胞系的建立［J］.青岛医药卫生，2012，44（1）：1－4.

［7］ Gupta S C，Sundaram C，Reuter S，et al.Inhibiting NF-kappaB activation by small molecules as a therapeutic strategy［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1799（10）：775－87.

［8］ Garg A，Aggarwal B B.Nuclear transcription factor-kappaB as a target for cancer drug development［J］.Leukemia，2002，16（6）：1053－68.

［9］ Aggarwal B B，Gehlot P.Inflammation and cancer：How friendly is the relationship for cancer patients？［J］Curr Opin Pharmacol，2009，9（4）：351－69.

［10］Tergaonkar V，Pando M，Vafa O，et al.P53 stabilization is decreased upon NF-kappaB activation：a role for NF-kappaB in acquisition of resistance to chemotherapy［J］.Cancer Cell，2002，1（5）：493－503.

NF-κB silencing inhibits the proliferation of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cell

Pan Hongjie1，Fan Caiwen1，Yi Shijiang2，et al
（1Dept of Pathology and Pathophysiology，Guilin Medical College，Guilin 541004；2Dept of Otorhinolaryngology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001）

ObjectiveTo evaluate the inhibition effects of nuclear factor-κB（NF-κB）silencing in the nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells.MethodsConstructing the NF-κB SiRNA expression vector pGenesil-1.2-NF-κB and emptor pGenesil-1.2-HK，and then they were transfected into nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells.Western blot was used to detect expression of NF-κB p65 protein.MTT and flow cytometry were used to evaluate the proliferation inhibition and the cell cycle arrest in 5-8F cells respectively.ResultsNF-κB p65 silencing could inhibit the proliferation of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells and the inhibition rate was（58.43±1.24）%，0%in the control group and（17.89±4.13）%in the empty vector control group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.The cell number of S phase was（42.27±0.39）%in NF-κB silencing group，（30.83±1.36）%in the control group and（34.88±0.85）%in the empty vector control group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe NF-κB p65 knockdown decrease cell proliferation in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells，maybe due to cell cycle arresting in S phase.

nuclear factor-κB；nasopharyngeal cancer；siRNA

R 739.6

1000－1492（2015）01－0016－04

2014－09－27接收

国家自然科学基金（编号：81260344）；广西研究生教育创新项目（编号：YCSZ2012110）；广西高等学校优秀人才资助计划项目；广西自然科学基金（编号：2013GXNSFAA019228）；桂林市科学研究与技术开发计划项目（编号：20130120-19）

1桂林医学院病理学与病理生理学教研室，桂林 5410042桂林医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，桂林 541001

潘红杰，女，硕士研究生；向 秋，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：guilin996＠163.com