淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒快速核酸检测方法

熊 炜，林颖峥，魏晓锋，王 艳，张 强，李 健，胡建华，黄忠荣

（1.上海出入境检验检疫局，上海 200135；2.上海实验动物研究中心，上海 201203）

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒快速核酸检测方法

熊 炜1，林颖峥1，魏晓锋2，王 艳1，张 强1，李 健1，胡建华2，黄忠荣1

（1.上海出入境检验检疫局，上海 200135；2.上海实验动物研究中心，上海 201203）

为加强口岸对进境野生及实验用啮齿类动物中淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）筛查和流行病学调查，本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR快速高通量检测LCMV的方法，证实两种核酸检测方法具有良好的特异性、灵敏性和稳定性，适于快速检测LCMV。

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒；RT-PCR；Real-time RT-PCR；Taqman探针

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）引起的淋巴细胞脉络丛脑膜炎，是一种啮齿类动物多发急性人畜共患传染病，其临床经过可有流行性感冒样症状至脑膜炎、脑炎等程度不等的表现，病程具有自限性[1，2]。LCMV在自然状态下可感染鼠、犬、猫、猴等多种动物和人类，其储存宿主包括小家鼠（Mus musculus）、家鼠（Mus domesticus）和仓鼠（Syrian hamster）等啮齿类动物[3-5]。美国一家癌症研究所1989 年发生的LCMV感染事件就从该研究所饲养的裸鼠中检测到LCMV阳性，并且有实验人员在对裸鼠进行肿瘤手术时被感染[2]。由于此类啮齿类动物遍布全球，广泛分布在人类的活动区域，人被感染LCMV的几率也较大。人感染LCMV的主要途径是直接接触带毒动物排泄物和分泌物。成年人感染LCMV后8 ～13天出现临床症状，其典型表现为发热、头痛、肌肉痛、呕吐等类似流感样症状，偶有单侧睾丸痛、妄言等症状；严重者表现为脑膜炎、听力下降；约三分之一的患者没有临床症状。LCMV为自限性疾病，致死率很低，人在感染l ～3周后能自行恢复，且通常预后良好。此外，曾有报道，LCMV可经母婴垂直传播导致婴儿畸形或出生后死亡，但经该途径传播的流行病学和临床症状还未完全清楚[6]。目前检测LCMV的方法主要有血清中和、免疫荧光、免疫组化、ELISA和RT-PCR等，这些传统检测方法受试样本具有一定的局限性，同时操作繁琐且灵敏度较低[7～10]。Real-time PCR技

术是一种新型的核酸检测技术，具有操作简便、敏感性高、适用于高通量核酸检测的特点，已被广泛应用病原微生物核酸的检测[11～12]。鉴于LCMV隐性感染的特征及人畜共患的危害性，为了加强对入境野生和实验用啮齿类动物中LCMV疫情筛查和流行病学调查，提高LCMV隐性携带动物的检出率，本研究建立了Real-time RT-PCR快速高通量检测LCMV的方法，并将其与RT-PCR方法进行对比，评估建立的LCMV核酸检测方法的特异性、敏感性和稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂。Trizol购自Invitrogen公司；Taq酶、AMV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP、随机引物、DNA Marker（DL2000）购自Takara公司。

1.1.2 病毒样品来源及处理。LCMV阳性组织样品、血清和细胞培养物源自上海实验动物研究中心。阳性组织样品加等体积生理盐水研磨匀浆，3000 g离心15 min，收集上清液待检。本研究使用的其他病毒，如小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus，MHV）、小鼠肺炎病毒（pneumonia virus of mice，MPV）、仙台病毒（Sendai virus，SV）、呼肠孤病毒3型（reovirus type 3，Reo-3）、小鼠小病毒（minute virus of mice，MVM）均来自上海实验动物研究中心。上述病毒样品经核酸分离提取制备成DNA或cDNA备用。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提及cDNA模板制备。取100 μL待检上清液或血清，加1 mL Trizol试剂，用枪头吹打20～30次；加入200μL氯仿，涡旋震荡30 s混匀；12000 r/min离心15 min；取上层水相，加500 μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20 min；12000 r/min离心10 min；弃上清，沉淀用1 mL DEPC水配制的75%乙醇清洗；7500 r/min离心10 min；弃上清，沉淀室温干燥10 min；加30 μL DEPC水溶解RNA沉淀。取11 μL RNA溶液，加5倍逆转录酶浓缩缓冲液4 μL、dNTP 1 μL、随机引物1 μL、RNA酶抑制剂1 μL、AMV逆转录酶2 μL，置PCR仪上42℃反应60 min，即得cDNA模板。

1.2.2 RT-PCR检测。正向引物（LCMVF）：5’AGT GAT GAG TCC TTC ACA TCC CA 3’，反向引物（LCMVR）：5’ GGA TCC TAG GCA TTT GAT TGC GC 3’，该引物针对LCMV的S基因的保守序列设计，其扩增基因片段大小为554 bp。在PCR薄壁管中，加cDNA模板2 μL、10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水补足总体积至25 μL。将PCR管置PCR仪上，按如下程序扩增 ：首先94℃ 3 min；然后94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，35个循环；最后72℃ 3 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统拍摄。

1.2.3 Real-time RT-PCR引物和TaqMan探针。使用Vector NTI Suite软件分析不同国家和地区分离的LCMV基因的保守序列，用Primer Express软件设计引物和TaqMan MGB探针，正向引物（TLCMVF） 为：5’ AGC AAC TTC CAC CGG ATC AT 3’，反向引物（TLCMVR）为：5’ TTG ATC CAA ATG CAC CCA CAT 3’，TaqMan MGB探针为 ：5’ CTA CCC TCA ATG TCT ATC 3’。引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成，引物和探针的浓度均为25 μM。

1.2.4 Real-time RT-PCR检测。采用ABI公司ViiA7荧光PCR仪。反应体系为：10倍Taq酶浓缩缓冲液2.5 μL、dNTP 0.5 μL、Taq酶0.25 μL、模板1 μL、上下游引物（TLCMVF、TLCMVR）各0.25 μL、TaqMan探针0.25 μL，加水补足总体积至25 μL。反应条件为：首先95℃ 3 min；然后95℃ 15 s，59 ℃ 45 s，40个循环，每个循环第二步收集荧光信号。

2 结果

2.1 RT-PCR和Real-time RT-PCR检测LCMV的特异性试验

针对LCMV基因保守序列，建立RT-PCR和Real-time RT-PCR检测LCMV方法。通过对比检测LCMV和其它鼠病毒，如MHV、MPV、SV、

Reo-3和MVM等，证实建立的RT-PCR方法和Real-time RT-PCR方法均具有良好的特异性。RTPCR仅扩增出了LCMV中的特异性基因片段，且条带单一（图1）；Real-time RT-PCR仅在LCMV阳性样本18个循环左右出现显著扩增，其对照病毒样品未见扩增（图2）。

图1 RT-PCR检测LCMV的特异性

图2 Real-time RT-PCR检测LCMV的特异性

2.2 RT-PCR和Real-time RT-PCR检测LCMV的敏感性试验 将LCMV阳性样品cDNA进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为10 ng/μL、1 ng/ μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/ μL、10 fg/μL、1 fg/μL的模板，再用建立的两种方法进行检测。结果显示，RT-PCR检测LCMV阳性cDNA模板的下限量为10 pg（图3），而Real-time RT-PCR检测LCMV cDNA模板的下限量为10 fg（图4）。

图3 RT-PCR检测LCMV的敏感性试验

图4 Real-time RT-PCR检测LCMV的敏感性试验

2.3 RT-PCR和Real-time RT-PCR检测LCMV的可靠性试验 为进一步验证所建LCMV核酸检测方法的可靠性，将15份LCMV阳性病料和细胞培养物，以及40份健康小鼠的不同组织样品，使用所建RT-PCR和Real-time RT-PCR方法进行检测。结果显示，15份LCMV阳性样品经RTPCR和Real-time RT-PCR检测均呈阳性（Ct值16.5～31.0），其余40份LCMV阴性样本经两种方法检测均为阴性（Ct值>38.0）。

3 讨论

研究表明，实验鼠感染LCMV有以下几种途径：第一，由野鼠污染引起，由于实验动物的饲料充足，环境适宜，很容易吸引野鼠，从而将LCMV带入，饲养在底层的小鼠比饲养在上层的小鼠血清检测LCMV阳性率更高，原因可能是野鼠的粪便和分泌物污染了动物房的地板或低矮设施；第二，经实验感染，如肿瘤移植手术，这样的污染原因是由细胞株或是实验器具被LCMV污染；第三，不同单位间大量动物交流或进出动物房人员太多而引起；第四，运输过程中感染。近年来实验动物LCMV感染率一直保持较低水平，这与实验动物硬件设施和管理水平的提高密不可分，更说明，

做好入境引种实验动物LCMV监测意义重大。

目前LCMV很少有在鼠群内急性暴发报道，绝大多数为不发病无症状的隐感染。由于传统的血清学检测方法灵敏度低，因此其漏检率较高。同时，由于LCMV的宿主范围较广且可在环境中长期存活，因此提高检测方法的敏感性，是降低实验动物感染LCMV的重要保障。

为了适应口岸对大量入境实验用啮齿类动物和野生动物快速检测LCMV的需要，本研究建立了RT-PCR和Real-time RT-PCR快速检测LCMV的方法。这些方法具有特异性强、敏感性高、稳定性好的特点，同时操作简便、迅速，其中Real-time RTPCR还是一种高通量的核酸检测技术，非常适合应用于口岸一线检疫实验室开展LCMV疫情监测。由于LCMV同时是一种人畜共患病，本研究建立的检测方法针对的样本广泛，除血液样本外，还可以是粪便、口鼻分泌物和组织样本等，这有助于提高口岸检疫人员采样的安全性，降低被动物咬伤、感染的几率。

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Establishment of Nucleic Acid Assays for Rapid Detection of Lymphocytic Choriomeningitis Virus

Xiong Wei1，Lin Yingzheng1，Wei Xiaofeng2，Wang Yan1，Zhang Qiang1，Li Jian1，Hu Jianhua2，Huang Zhongrong1
（1. Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135；2. Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203）

In order to survey and conduct epidemiological investigation of lymphocytic choriomeningitis virus（LCMV）among wild and experimental rodent animals，RT-PCR assay and Real-time RT-PCR assay were established using TaqMan probe for LCMV with high sensitivity，specificity and stability for rapid detection of LCMV.

lymphocytic chorimeningtis virus，RT-PCR，real-time RT-PCR，TaqMan probe

S852.659.5；S858.299

A

1005-944X（2015）04-0075-04

上海市科委科研项目（编号13DZ0502500）