教学实验中不同方法测定安痛定注射液中安替比林含量的比较

郁韵秋+李霞+李嫣

摘要：教学实验中有关安痛定注射液中安替比林的测定方法采用的是双波长法，现采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）对其进行了测定，并对两种方法的结果进行了比较和评价。采用t检验法对两组数据进行了比较，说明在学生实验中可以以HPLC法代替双波长法进行安替比林的含量测定。此项实验的目的：（1）使学生更深入地理解分析方法的原理，并且懂得同样的化合物可选择不同的分析方法;（2）使学生将统计检验的方法运用到具体案例中。

关键词：双波长法;高效液相色谱法;安痛定注射液;安替比林;教学实验

中图分类号：G642.41     文献标志码：A     文章编号：1674-9324（2015）20-0214-02

分析化学是医、药学院校本科教学的必修课，也是一门基础课程，其理论知识和实验技能是药物分析学、药物化学、天然药物化学、药剂学、药理学和中药学等各学科的必备基础[1]。分析化学教学不仅要求学生掌握有关的基础知识和基本原理，而且要求学生学习和掌握基本的实验操作和技能，将分析化学的原理与分析实验有机地融合是至关重要的。因此，我们在教学过程中进行了多方面的探索，启迪学生积极思考，提高其分析问题和解决问题的能力。在学习基本知识的同时，学会融会贯通，用学到的知识去指导实验设计，反之，对于具体的分析对象要懂得如何选择分析方法。

对于某些药品（比如复方制剂）的测定，双波长法可以消除干扰组分而达到测定目的;HPLC法具有分离分析的功能，也可以消除干扰而进行目标组分的测定。因此，我们采用HPLC法对安痛定注射液中安替比林的含量进行了测定，并将测定结果与原来教学实验中采用的双波长法进行了比较和分析。

一、试剂

氨基比林、安替比林对照品均购自中国药品生物制品检定所，甲醇（色谱纯）购自德国默克化工试剂公司，盐酸（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司，去离子水由Millipore Direct-Q纯水发生器制得。

二、高效液相色谱法

1.色谱条件。

仪器：Agilent_HPLC_1200系列

色谱柱：Welch Ultimate○AQ-C18（4.6x250mm，5μm）

流动相：甲醇∶水（60∶40）

流速：0.8mL/mim

柱温：30℃

检测波长：260nm

进样体积：10μL

色谱分析工作站：Agilent ChemStation

2.溶液制备。

（1）储备液。精密称取氨基比林和安替比林各50mg，分别置于50mL容量瓶，加甲醇溶解，制得氨基比林甲醇溶液，1mg/mL;氨替比林甲醇溶液，1mg/mL。4℃储藏。

（2）标准曲线。用60∶40（v/v）的甲醇水溶液将储备液稀释成含氨基比林2、5、10、15、20、25、30μg/mL（含10μg/mL的氨基比林）的溶液。

（3）样品。取安替比林和氨基比林储备液适量，用流动相稀释成含安替比林10μg/mL（含10μg/mL的氨基比林）的溶液5份。

3.方法学验证及样品测定。在上述色谱条件下安替比林和氨基比林得到完全分离，峰形对称性好且无明显的干扰峰。安替比林和氨基比林的保留时间分别为5.12分钟和6.62分钟。

（1）线性范围。依照上述标准曲线配置法，配制成含氨基比林2、5、10、15、20、25、30μg/mL，并含10μg/mL的氨基比林的溶液。依照上述色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图。以色谱图峰面积为纵坐标（y），氨基比林浓度（μg/mL）为横坐标（x），以最小二乘法进行回归分析，得标准曲线。结果显示，安替比林在2～30μg/mL的范围内，线性良好。其中回归方程为y=35.441x-1.4319，R=0.9996。

（2）准确度和精密度。配制含氨基比林5、15、30μg/mL（含10μg/mL氨基比林）的低（L）、中（M）、高（H）三个水平的标准液，每个浓度水平各5份，依照上述色谱条件，连续进样三天，记录色谱图，以进行日内和日间精密度与准确度的考察。其中精密度以相对标准差（relative standard deviation，RSD）来表示，准确度以相对误差（relative error，RE）来表示。结果如表1所示。

（3）样品测定。依照上述样品制备法制备含安替比林10μg/mL（含10μg/mL的氨基比林）的溶液5份，依照上述色谱条件进行HPLC分析。结果如表2所示。

三、双波长法

1.测定条件。仪器：HITACHI U-2900

2.测定方法及结果。

（1）λ1与λ2的选定。用HCl（0.1mol/L）为溶剂，将氨基比林储备液稀释至约5μg/mL，以HCl为空白测定吸光度，在230nm附近和265nm附近各找5个不同波长的吸光度，找出吸光度相等的λ■与λ■。根据实验结果选择的两个波长为：λ■=231nm，λ■=268nm。

（2）安替比林标准品及模拟样品的测定。用HCl（0.1mol/L）为溶剂，将氨替比林储备液稀释至约5μg/mL，以HCl为空白测定吸光度，测定其在λ1与λ2处的吸光度A1和A2。用HCl（0.1mol/L）为溶剂，将氨基比林和安替比林储备液稀释至含氨基比林和安替比林各10μg/mL的模拟样品溶液，以HCl为空白测定吸光度，测定其在λ1与λ2处的吸光度A■′和A■′。以上测定步骤重复进行5次，记录结果，以下式计算安替比林浓度。结果如表2所示。

四、F检验和t检验

由HPLC法和双波长法测定浓度为10μg/mL的安替比林样品，结果如表3所示。

F检验F=1.36，查表得F■=5.05，F

t检验t=0.617，查表得双侧检验t■=2.228，t

五、讨论

双波长法和高效液相色谱法都可用于多组分的含量测定，在有些分析工作中两种方法是互相验证或替代的。作为现代化的分析检测手段，HPLC法的应用日益广泛，《中国药典》中涉及HPLC法进行含量测定的项目，已从1985版中的8项增加到2010版中的千余项[2]。在测定安痛定注射液中安替比林的含量时，应用HPLC法和双波长法的结果说明：高效液相色谱法快速、灵敏，适合批量样品多种成分的同时、快速测定;双波长法简单、准确，适合少量样品的快速测定。在学生实验中，采取两种方法测定安痛定注射液中安替比林的含量，并且运用统计检验手段对方法进行简要评价，不仅可以使学生了解仪器分析的原理，而且要关注仪器分析方法和应用的进展和动态，对于给定的分析任务，可以结合方法原理选择不同的分析方法，逐步培养灵活、多元化的思维方式。

参考文献：

[1]李玲，刘健，周践，等.从历版中国药典分析方法的统计与研究看我国药物分析方法的发展[J].药物分析杂志，1998，18（05）：349-352.

[2]刘红云，郑举，张莉，等.HPLC法同时测定安痛定注射液中氨基比林和安替比林的含量[J].中国兽药杂志，2009，43（9）：5-7.