云南省西双版纳州傣族G6PD缺陷症发生率及突变谱研究

詹小芬张芹周露杨辉杨惠钿杨立业林敏★

·论著·

云南省西双版纳州傣族G6PD缺陷症发生率及突变谱研究

詹小芬1张芹2周露3杨辉1杨惠钿1杨立业1林敏1★

目的了解云南省西双版纳州傣族人群的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症的发生率及基因型。方法在2012年8月至2013年9月期间，用荧光斑点定性法对812例傣族居民进行G6PD缺乏筛查。用反向斑点杂交芯片和PCR-DNA测序法分析G6PD缺乏症的标本的基因型。结果云南西双版纳州傣族人群的G6PD缺乏症总发生率为9.73％（79／812），其中男性32例（9.07％，32／353），女性47例（10.24％，47／459）。79例初筛G6PD缺乏标本65例检测出有突变，共检出8种基因突变类型，含16例1376G＞T（24.24％）、10例1311C＞T（15.15％）、9例1388G＞A（13.63％）、7例392G＞T（10.60％）、6例95A＞G（9.09％）、5例1360C＞T（7.57％）、2例871G＞A（3.03％）、1例1024C＞T（1.52％），和6种复合突变包括2例G871A／C1311T（3.03％）、2例G392T／G1376T（3.03％）、2例G392T／G1388A（3.03％）、1例C1024T／C1311T（1.52％）、1例C1311T／G1376T（1.52％）、1例C1311T／G1388（1.52％）。结论云南西双版纳州傣族G6PD缺乏症检出率高，最常见的三种基因型是G6PD1376G＞T、1311C＞T和G6PD1388G＞A。在西双版纳地区当地开展G6PD缺乏症的新生儿筛查、产前筛查和遗传咨询是非常有必要的。

G6PD缺乏症；傣族；基因突变；斑点杂交；PCR-DNA测序

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenas，G6PD）缺乏症，又称蚕豆病，是由G6PD基因发生突变而引起的一种X染色体连锁不完全显性遗传性溶血性酶缺陷疾病［1］。大部份人终身没有任何临床症状，只有在某些诱因下（抗疟药物、蚕豆等），可导致急性溶血性贫血、核黄疸等一系列病理改变。此病虽呈全球性分布，但各人种和地区存在差异，总体呈“南高北低”趋势［2］。云南省是我国少数民族最多的省份，G6PD缺乏症也是云南少数民族地区高发的遗传性疾病。傣族，也称“泰老民族”或“傣泰民族”，源于中国的云贵高原，是世居云南的少数民族之一。

本文对西双版纳州景洪市的傣族人群进行了G6PD缺乏症的分子流行病学调查，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2013年8月至2013年9月，在西双版纳州景洪市农垦医院采集了体检的傣族812名人的血样标本，包括353名男性，459名女性。本研究得到云南省第一人民医院伦理委员会、南方医科大学附属潮州市中心医院伦理委员会批准。在获得患者的知情同意之后，用Whatman S＆S903滤纸制备干血斑，自然干燥后密封保存于4℃备用。

1.2 G6PD荧光斑点定性试验

用G6PD活性筛查试剂盒（纯化学反应荧光法）（广州米基医疗器械有限公司，广州）进行G6PD活性筛查，按试剂盒说明书进行操作。结果判断标准如下——活性正常者：10 m in内出现强荧光；中度缺乏者：10 m in～30 m in出现荧光为中度缺乏值；重度缺乏或完全缺乏：30 m in不出现荧光［3］。

1.3 基因分型

1.3.1 基因组DNA提取

用Chelex法提取G6PD酶学异常标本的DNA［3］：首先剪切0.5 cm×0.5 cm滤纸血斑，加500μL去离子蒸馏水，震荡30 s，然后静置半小时以上；接着震荡后用13 600 rpm离心4 m in，弃上清，加160μL的10％浓度的Chelex-100悬液，振荡后用56℃孵育2 h，接着98℃变性8 min，振荡30 s，13 500 rpm离心1 m in；最后放置于4℃冰箱冷却30 m in，吸取上清备用。

1.3.2 基因分型流程

采用广东凯普生物公司生产的G6PD缺乏症基因检测试剂盒（PCR＋反向斑点杂交）检测13个中国人常见G6PD基因突变位点，分别为：A95G、G392T、A493G、C592T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、G871A、C1004T、C1024T、C1387T、G1388A。PCR、斑点杂交及结果判读严格按照说明书执行。对用反向斑点杂交未检测出G6PD基因突变的标本进行2至13号外显子进行测序，方法均按照本实验室以往文献［2］。

2 结果

在812例傣族中，共检出G6PD酶学缺乏的样本79例，总检出率为9.73％。其中，男女检出率分别为9.07％（32／353）和10.24％（47／459）。男性检出率略低于女性检测率，但两者之间不存在统计学差异（χ2＝0.313，P＝0.576）。

79例G6PD酶学缺陷样本经反向斑点杂交芯片分析，在65例（男29例，女36例）样本中发现G6PD存在突变，占82.3％。部分膜反向斑点杂交结果见图1。样本共检出8种G6PD基因点突变，包括95A＞G（c.185A＞G）、392G＞T（c.482G＞T）、871G＞A（c.961G＞A）、1024C＞T（c.1114C＞T）、1311C＞T（c.1401C＞T）、1360C＞T（c.1450C＞T）、1376G＞T（c.1466G＞T）、1388G＞A（c.1478G＞A）。检出6种复合突变包括G871A／C1311T、G392T／G1376T、G392T／G1388A、C1024T／C1311T、C1311T／G1376T、C1311T／G1388A，结果详见表1。傣族人群最常见的基因型为1376G＞T（24.61％，16／65）和1311C＞T（15.38％，10／65），其次是1388G＞A（13.84％，9／66），3种点突变占所有病例总数的50％以上，男性半合子未发现有C1024T基因型。此外，还有14例（女11例，男3例）经膜反向斑点杂交未检测出突变的样本，进行2～13外显子和外显子-内含子接合区进行基因测序检测，与人G6PD基因序列（GeneBank：NC＿000023.10）进行比对，未发现其他突变。

3 讨论

表1 傣族人群G6PD缺乏症患者基因型结果Table 1 Genotyping results of G6PD deficiency among Dai population

图1 G6PD基因突变部分膜反向斑点杂交结果Figure 1 Results of reverse dot blot analysis for G6PD mutations

G6PD缺乏症是最常见的一种遗传性酶缺乏病，全世界约4亿人受累。我国是本病的高发区之

一，主要分布在长江以南各省，以云南，广东，广西，海南，贵州等省为高，其发病原因是由于G6PD基因突变，导致酶活性降低，红细胞不能抵抗氧化损伤而遭受破坏，引起溶血性贫血。本次筛查结果发现西双版纳州地区傣族人群的G6PD缺乏症总发生率为9.73％，低于1987年云南省计划生育研究所在德宏州调查的傣族为16.1％的结果［4］，高于忽丽莎等研究的西双版纳州傣族2.6％的结果［5］，这可能与不同民族，地区或者不同的研究方法有关。目前，用于G6PD缺乏症筛查的方法很多，G6PD荧光斑点试验是国际血液学标准委会（ICSH）推荐用于G6PD缺乏症的方法，具有较好的敏感性和特异性。本次筛查男性G6PD缺乏症检出率为9.07％，女性G6PD缺乏症检出率为10.24％。虽然女性发生率略高于男性，但两者之间无统计学意义（χ2＝0.313，P＝0.576）。这可能是由于筛查的人数少、抽样偏差所造成的。女性纯合子和杂合子的估算可从男性检出率读出，但G6PD缺乏率只代表有表现型的发生率，女性杂合子不易全部检出，因此发生率会比估计值偏低。G6PD基因型的确定有助于G6PD缺乏症的明确诊断，尤其是酶活性差异很大的女性杂合子。

PCR＋膜杂交法的检测原理是采用生物素标记的引物分别对G6PD基因突变区域进行特异性扩增，将扩增产物与固定在尼龙膜上的不同突变位点探针在导流杂交仪上进行导流杂交（flowthrough hybridization），然后通过化学显色对结果进行判读。具有准确性高，特异性好，低DNA浓度也能准确检出等优点。试剂盒能实现对多个突变位点的同步检测。本次筛查的79例G6PD缺乏样本中有65例存在突变，共发现了8种基因点突变，以1376G＞T、1311C＞T、1388G＞A这3种突变为主，其次是392G＞T、95 A＞G、1360C＞T、871G＞A、1024C＞T。我们还发现了6种复合突变包括G871A／C1311T、G392T／G1376T、G392T／G1388A、C1024T／C1311T、C1311T／G1376T、C1311T／G1388A。本次研究结果以1376G＞T最常见。与以往调查的云南傣族以G1388A为最常见突变类型不同［6］，也与我国南方的壮、瑶、傣、苗、黎、畲族等少数民族G6PD缺乏症以G1376T和G1388A为主不同［7］。本次研究结果虽然1376G＞T（24.61％）大于1388 G＞A（13.84％），但还是以1376G＞T和1388G＞A突变类型为主，符合中国人群最常见的2种G6PD基因突变类型。这种可能是由于以往多采用AMRS-PCR或PCR-RFLP法对突变进行鉴定［8］，能够鉴定的突变类型较少，而此次我们斑点杂交芯片能鉴定的类型较多，因此造成比例的不同。我们还发现了大量的C1311T（15.38％）突变，除了G871A／C1311T、C1024T／C1311T、C1311T／G1376T、C1311T／G1388A四种复合突变外，10例C1311T突变的酶学结果也降低。由于C1311T是同义突变，不引起功能的改变，在临床上是属于良性的，因此，我们推测C1311T同时合并（除了13种常见位点外）的其它有功能的外显子的突变，而引起酶活性降低［8］。

西双版纳傣族自治州属于G6PD缺乏症高发区，开展G6PD缺乏症的筛查，指导临床医生用药、G6PD缺乏症基因型的诊断、防止携带者通婚、能够提高人口素质和促进优生优育工作的进行。

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The prevalence and mutation s distribution of G6PD deficiency among Daipopulation in Xishuangbanna region,Yunnan province

ZHAN Xiaofen1,ZHANG Qin2,ZHOU Lu3,YANG Hui1,YANG Huitian1,YANG Liye1,LIN M in1★
(1.The Central Laboratory,Affiliated Chaozhou Central Hospital,Southern Medical University,Chaozhou, Guangdong,China,521000；2.The Medical Laboratory,First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunm ing，Yunnan,China,650000；3.The Medical Laboratory,Xishuangbanna Agricultural Reclamation Hospital,Jinghong,Xishuangbanna,Yunnan,China,666100)

Objective To investigate the prevalence and mutation distribution of Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)deficiency among Dai population in Xishuangbanna region,Yunnan province.Methods From Aug 2012 to Sep 2013,812 Dai subjects were screened for G6PD deficiency by fluorescent spot test(FST).Then,all the screening positive samples were identified by reverse dot blot (RDB)chip and PCR-DNA sequencing.Results The prevalence of G6PD deficiency was 9.73％(79/812) among Dai population,of which 9.07％(32/353)in males and 10.24％(47/459)in females.Totally,65 of

Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD)deficiency；Dai population；mutation；Reverse dot blot(RDB)；PCR-DNA sequencing

国家自然科学基金（81101329）；中国博士后科研基金（2013M 542195）；广东省医学科研基金（A2013780）

1.南方医科大学附属潮州市中心医院中心实验室，广东，潮州521000 2.云南省第一人民医院检验科，云南，昆明650000 3.西双版纳农垦医院检验科，云南，西双版纳傣族自治州，景洪666100

★通讯作者：林敏，E-mail：konfutea＠hotmail.com

the 79 screening positive samples were detected w ith coding mutations in G6PD gene that encompassing 8 kind of mutation types included 16 cases of 1376 G＞T(24.24％),10 cases of 1311C＞T(15.15％),9 cases of 1388 G＞A(13.63％),7 cases of 392 G＞T(10.60％),6 cases of 95 A＞G(9.09％),5 cases of 1360 C＞T(7.57％),2 cases of 871 G＞A(3.03％)and 1 cases of 1024 C＞T(1.52％).At the same time,6 kind of compound mutation are observed in our study cohort including 2 cases of G871A/C1311T(3.03％), 2 cases of G392T/G1376T(3.03％),2 cases of G392T/G1388A(3.03％),1 cases of C1024T/C1311T (1.52％),1 cases of C1311T/G1376T(1.52％)and 1 cases of C1311T/G1388(1.52％).Conclusion The prevalence of G6PD deficiency was high among Dai population.G6PD 1376 G＞T、1311C＞T and G6PD1388 G＞A were the 3 most common mutations in this region.Obligatory newborn screening program, prenatal screening and counseling for G6PD deficiency were importantand necessary in Xishuangbannan region.