两例短串联重复序列三带型等位基因的遗传多态性分析

许泽辉严提珍罗世强王秋华唐宁★

·论著·

两例短串联重复序列三带型等位基因的遗传多态性分析

许泽辉1，2严提珍1，2罗世强1，2王秋华1，2唐宁1，2★

目的本文分析亲子鉴定常用STR基因座的三带型等位基因特点。方法用Chelex法提取3 600例亲子鉴定检案（含8 734个个体）血液中的基因组DNA，利用美国ABI公司Amp FISTRR®IdentifilerTMplus试剂盒进行复合荧光PCR扩增确定STR基因座的遗传图谱（ABI 3500Dx遗传分析仪），若出现异常峰型则采用PowerPlex®21系统进行复查验证和采用Yunis技术进行淋巴细胞染色体核型分析。结果2个检案分别在D18S51和FGA基因座上出现三带型等位基因现象（均属于Ⅰ型），总检出率为0.229‰（2／8 734），携带三带型等位基因的个体经染色体核型分析均未发现三体综合征。结论三带型等位基因结果较少见，判读须慎重，应采用不同试剂盒进行验证以获得准确分型。

短串联重复序列；三带型等位基因；遗传多态性

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）是一类存在于真核生物基因组中以2～6个碱基对为核心单位串联重复排列而成的DNA序列。由于STR基因座的高度遗传多态性和其在基因传递过程中遵循孟德尔共显性遗传规律等特点，PCRSTR复合扩增荧光检测技术成为国际法医学界不可或缺的一项重要技术手段，目前被广泛应用于群体遗传学、亲权关系鉴定、罪犯识别、疾病分析等方面。正常情况下，任何一个STR基因座均表现为两个等位基因（一个为父源性，另一个为母源性），经PCR扩增和电泳分析后，纯合子个体的图谱只表现为单一条带或单个基因峰，杂合子个体则表现为两条带或两个基因峰，不会出现三带型或三个基因峰的现象。Crouse等［1］首次于1999年报道了三等位基因（tri-allelic pattern）或三带型等位基因（three-banded allele pattern）现象。根据各个等位基因的相对荧光强度可把三带型等位基因分为两种类型：一种是荧光强度低的两个“小峰”的峰高、峰面积之和等于荧光强度高的主峰的峰高、峰面积（Ⅰ型）；另一种是3个峰的峰高、峰面积接近相等（Ⅱ型）［2］。随着PCR-STR复合扩增荧光检测技术的发展，世界各个法医鉴定实验室或鉴定机构接待的案例越来越多，三带型等位基因陆续被报道。截至2014年12月10日，三带型等位基因在13个核心STR基因座（TPOX、CSF1PO、FGA、TH01、vWA、D3S1358、D5S818、D8S1179、D7S820、D13S317、D16S539、D18S51和D21S11）中已报道了247例，其中以D18S51和FGA基因座的频率最高，分别为38种和37种，vWA和D21S11基因座则均有24种［3］。本文通过大样本分析，对三带型等位基因的特点和产生原因进行了探讨，报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

采集2012年8月到2014年8月柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室亲子鉴定检案3 600例（包括8 734个中国人群个体），检材为人体血样、带毛囊毛发、羊水、组织等。

1.2 方法

1.2.1 Chelex-100法提取血斑DNA

按照文献［4］报道采用Chelex-100法提取血斑DNA。剪取受检样本约0.5 cm2的血斑，加到0.5 m L的离心管中，加入500μL纯水，剧烈振荡，室温下放置15m in。13 000 rpm离心3m in，去上清，收集沉淀。在沉淀中加入200μL 5％Chelex-100溶液，在振荡器上反复振荡，放入56℃保温30 m in以上。取出后振荡，100℃保温8m in，振荡后13 000 rpm离心3 min，上清用于PCR扩增，或放4℃保存备用。

1.2.2 复合荧光扩增和毛细管电泳检测

运用美国ABI公司AmpFISTRR®IdentifilerTMplus试剂盒（包括16个STR位点：CSF1P0、D7S820、D8S1179、D21S11、D2S1338、D3S1358、D13S317、D16S539、TH01、D18S51、D19S433、TPOX、vWA、D5S818、FGA和Amelogenin）进行复合荧光PCR扩增，若发现出现异常峰型则采用PowerPlex®21系统（包括20个STR位点和1个性别位点：D1S1656、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、Amelogenin、CSF1PO、FGA、Penta D、Penta E、TH01、TPOX和vWA）进行复查验证，严格按照试剂盒说明书进行操作。在美国ABI公司3500Dx遗传分析仪上进行荧光检测分析，最后采用GeneMapper ID-X-V1.4软件进行数据分析。

1.2.3 染色体核型分析

外周血细胞染色体核型分析采用淋巴细胞培养，常规步骤制备染色体，G显带，镜下计数和分析核型。严格按照SOP文件进行操作［5］。

2 结果

2.1 D18S51和FGA基因座毛细管电泳结果

检测3 600个检案的血滤纸样本，结果发现2例亲子鉴定的个案中出现了三带型等位基因。2例三带型等位基因结果见表1。利用Amp FISTRR® IdentifilerTMplus试剂盒对2个检案的父亲、母亲和孩子的血样DNA进行16个STR位点检测，其中D18S51和FGA基因座的毛细管电泳检测结果见图1。个案1母亲和个案2孩子的DNA样品用PowerPlex®21系统重复验证，进行21个STR位点检测，其中D18S51基因座的毛细管电泳结果见图2。与图1比较可见，个案1母亲的D18S51基因座结果一致，都检出17／18／19三个等位基因，

其信号强度、峰高和峰面积之比约等于2∶1∶1，其中，等位基因19遗传给了孩子；个案2孩子的FGA基因座结果也一致，均检出22／23／26三个等位基因，其信号强度、峰高和峰面积之比约等于1∶1∶2，其中23等位基因来自父亲，26等位基因来自母亲，22等位基因在双亲均未发现。

2.2 染色体核型分析结果

对2个携带三带型等位基因的个体进行了外周血淋巴细胞染色体核型分析，检案1母亲的核型为46，XX，检案2孩子的核型为46，XY，均未见染色体数目和结构明显异常。结果表明这2个个体未见染色体畸变现象（图3）。

表1 亲子鉴定中三带型等位基因的遗传分析Table 1 Genetic analysis of three-banded allele patterns in paternity testing

图1 Ⅰ型三带型等位基因携带者的亲子鉴定图谱Figure 1 STR profiles of paternity testing with the three-banded allele pattern of TypeⅠ

3 讨论

STR是国内外法医学亲子鉴定和个体识别的主要方法，其适用于各种来源的生物性检材，具有灵敏度高、个体识别机率和非父排除率高、PCR检测所需检材量少等优点。STR主要是在DNA复制

过程中滑动，或复制和修复时滑动链与互补链碱基错配，引起一个或几个重复单位的缺失或插入而形成。单个STR基因座的PCR扩增，其图谱一般是杂合子个体有2个峰或2条带，而纯合子个体则只有1个峰或1条带，正常情况下不会出现3个峰或3条带。但是，在STR的应用过程中发现了一些个体的STR基因座出现3个峰或3条带（即三带型等位基因）。据STRbase的相关统计，目前已报道三带型等位基因有363种，其中13个核心STR基因座共247种，其它常见STR基因座（包括D2S1338、D19S433、Penta D、Penta E、FES／FPS、 SE33、D10S1248和D12S391）共52种，Y染色体STR基因座共64种［3］。

图2 D18S51和FGA基因座三等位基因图谱（PowerPlex®21 system）Figure 2 Three-banded allele patterns observed at locus D18S51and FGA（PowerPlex®21 system）

图3 三带型等位基因携带者的淋巴细胞染色体核型分析结果Figure 3 The results of karyotype analysis of the lymphocytes from the three-banded allele pattern carriers

国内研究显示三带型等位基因在中国人群的检出率很低（检出总频率为0.721‰），不同基因座的三等型等位基因检出率存在差异，以D21S11、D18S51和FGA基因座的检出率较高，检出率分别为0.172‰、0.137‰和0.103‰［6］。本研究在D18S51和FGA基因组上检出三带型等位基因，检出率为0.114‰（1／8734），这与其他大样本的三带型等位基因研究结果一致［6－7］。研究者发现不同STR基因座三带型等位基因的类型分布不同，他们的分

析结果表明D8S1179基因座三带型等位基因以Ⅱ型为主（占35％），Ⅰ型占7％；D18S51基因座三带型等位基因则以Ⅰ型为主（为33％），Ⅱ型为12％；同时提出体细胞突变可能是Ⅰ型三带型等位基因的形成的主要原因，而染色体重组或生殖细胞中染色体片段的局部重复可导致Ⅱ型三带型等位基因的形成［2］。本研究在3 600例亲子鉴定（包括8 734个个体）案件中发现了2例Ⅰ型三带型等位基因，峰高较低的两个等位基因均只相差一个核心重复序列，推测可能是原本为杂合子的两个等位基因在个体发育过程中，其中一个等位基因发生了一步滑动错配，从而产生新的等位基因［2，8］。我们重复提取DNA，按不同试剂盒说明书进行PCR扩增（Amp FISTRR®IdentifilerTMplus试剂盒和PowerPlex®21系统）、毛细管电泳、分析，其检测结果相吻合，提示检出的三带型等位基因不是PCR扩增引起的非特异产物，也不是实验室的污染或电泳时泳道渗漏造成的假象。

目前关于三带型等位基因产生的机制尚不太清楚，研究者们［2，9-10］认为可能的机制主要体现在以下几个方面：（1）在减数分裂时父系或母系同源染色体不分离而整体遗传给子代，即出现三多倍体现象。三带型等位基因的出现在染色体畸形导致的三体综合征时比较常见，但是在正常人群中出现频率较低，本文案例1的母亲D18S51基因座出现了17／18／19三带型等位基因，其余STR位点正常，怀疑该母亲患有18三体综合征，虽然该病患者寿命一般很短，但是也有报道发现成年人18三体病例。我们对该母亲外周血进行细胞染色体核型分析后发现，18号染色体并未增多，可见该母亲在18号染色体上出现的三带型等位基因并非由于父系或母系同源染色体在减数分裂时不分离而整体遗传给子代而造成的。（2）同源染色体在减数分裂时出现不等价交换导致等位基因重复。个体发生易位（translocation），染色体或某些位点有重复均可影响STR的分型结果。如果重复伴随有核心重复序列的缺失或插入，可形成三条带的带型。（3）在受精卵发育过程中染色体不分离产生不同基因型细胞组成的嵌合体（由两种或多种不同染色体核型的细胞组成），在PCR-STR分型时也可形成三带型等位基因。（4）STR的不稳定性与许多肿瘤有关，包括肺癌、消化道肿瘤、前列腺癌、妇科肿瘤、肾肿瘤和白血病等。发生肿瘤病变的组织或细胞，可以在一些STR位点检出三条或三条以上的带。（5）骨髓移植或脐血移植受者体内有供者的细胞生长，这些特殊个体在PCR-STR分型中，可以检出有多条带，或不同组织检出不同的基因型。

近几年来关于三带型等位基因是如何遗传给后代的课题已成为新的研究热点。2008年Vidal等［11］通过三代5个家庭成员的家系分析发现孙女D3S1358基因座三带型等位基因来源于其祖母。土耳其一对近亲结婚（哥哥和妹妹）的夫妇，他们均为三带型等位基因携带者（携带16／17／18等位基因），生下了一个四等位基因（17和18等位基因均为双拷贝）的孩子［12］。巴西里约热内卢天主教大学研究团队采集了一个四代45个家庭成员的大家系，发现6名女性成员携带TPOX基因座的三带型等位基因（属于Ⅱ型），核型结果显示2号染色体短臂未见部分三体。携带者的基因型均为8／10／11，推测携带者所有细胞的TPOX基因座序列为三拷贝，10等位基因为TPOX基因座的额外形成的第三个等位基因，因其距离TPOX基因座较远，推测10等位基因可能与Xq存在连锁关系［13］。2014年国内学者提出Ⅰ型三带型携带者随机传递一个等位基因给子代，Ⅱ型携带者可遗传两个等位基因给子代［6］。在本文的2例检案中，检案1虽然没有遗传给后代，但特别值得一提。母亲的17等位基因的峰面积约等于18、19等位基因峰面积的总和，提示等位基因17可能有两个拷贝，它的基因型可能是17／18和17／19，在减数分裂时，染色体分离并将其中一条传给子代，但子代中并没有出现17／19等位基因，只有19等位基因传给了子代。检案2的三带型等位基因只发现于孩子中，父母均正常，无法了解是否会遗传。本研究检出三带型等位基因例数较少，并且仅观察了两代的遗传情况，进行多代研究和积累更多的案例是后续研究的方向。目前对于亲子鉴定案件涉及的三带型STR基因座尚无统一的亲权指数（paternity index，PI）计算方法［14］，一般将亲代传给子代的两个等位基因视为整体进行计算［15］。

综上所述，在亲子鉴定检案中三带型等位基因现象极为少见，容易被忽视。因此，在PCR-STR

分型时出现此现象需引起重视。若发现可疑三带型等位基因，需要进行重复试验（包括标本提取、PCR扩增和电泳分析等全过程），排除泳道渗漏或者模板污染等问题；同时采用其他试剂盒或方法相互验证结果以免发生误判，保证鉴定结论的准确性、可靠性和科学性。

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Genetic polymorphism analysis of two short tandem repeat three-banded allele patterns

XU Zehui1,2,YAN Tizhen1,2,LUO Shiqiang1,2,WANG Qiuhua1,2,TANG Ning1,2★
(1.Department of Clinical Laboratory,Liuzhou Maternal and Child Care Hospital,Liuzhou,Guangxi,China, 545001；2.Liuzhou Key Laboratory of Birth Disease Prevention and Control,Liuzhou,Guangxi,China, 545001)

Objective To analyze t he characteristics of three-banded alleles patterns.Methods Genom ic DNA was extracted from blood samples of 3 600 paternity cases(including 8 734 individuals)by using Chelex method.Genetic profiles of STR loci were determ ined by multiplex fluorescence PCR amplification w ith the Amp FISTRR®IdentifilerTMplus kit(ABI,America).Re-analysis was performed by using the PowerPlex®21 system,and the karyotype of lymphocytes was analysed by Yunis'technique.

Short tandem repeat；Three-banded allele pattern；Genetic polymorphism

柳州市科学研究与技术开发计划项目（2014G020404）

1.柳州市妇幼保健院检验科，广西，柳州545001 2.柳州市出生缺陷预防与控制重点实验室，广西，柳州545001

★通讯作者：唐宁，E-mail：tn825＠126.com

注：许泽辉，严提珍为并列第一作者

Results 2 Type1 three-banded allele patterns at D18S51 and FGA loci were observed.The frequency for tri-allelic patterns in autosomal STRs was 0.229‰.Karyotype analysis showed no occurrence of trisomy w ith the three-banded patterns carriers.Conclusion Three-banded allele pattern events are extremely rare in paternity cases which need to be carefully assessed,and different amplification kit should be used to validate the results to obtain accurate genotyping.