赤道几内亚比奥科岛居民的镰型红细胞病的流行病学调查

谢东德陈江涛Urbano Monsuy EyiRocio Apicante MatesaMaximo M iko Ondo ObonoCarlos Sala Ehapo岳亮郭翼华古杰超詹小芬杨辉杨惠钿杨立业林敏★

·论著·

赤道几内亚比奥科岛居民的镰型红细胞病的流行病学调查

谢东德1，2陈江涛1，3Urbano Monsuy Eyi4Rocio Apicante Matesa4Maximo M iko Ondo Obono5Carlos Sala Ehapo5岳亮6郭翼华2古杰超2詹小芬6杨辉6杨惠钿6杨立业6林敏6★

目的了解非洲赤道几内亚比奥科岛（Bioko Island）人群的镰刀形红细胞病（sickle cell disease，SCD）的流行病学特点。方法在2013年1月至12月期间，采用红细胞镰变试验对1 036名本岛居民进行筛查。用高分辨熔解曲线（high-resolution melting，HRM）分析和PCR-DNA测序法对筛查阳性的标本进行基因型鉴定。结果赤道几内亚比奥科岛居民的SCD发生率为16.99％（176／1 036）。HRM法与PCR-DNA测序法具有较好的一致性（100％）。结论比奥科岛是SCD高发区，当地政府和卫生部门应采取有效的干预措施来减少这种疾病的危害。HRM法对SCD的鉴定准确性较高。

镰刀形红细胞病；比奥科岛；高分辨熔解曲线分析；PCR-DNA测序

镰刀形红细胞病（sickle Cell Disease，SCD）是世界范围最为常见和临床上最重要的一种常染色体隐性遗传血红蛋白病，它是由β珠蛋白基因的6号密码子GAG＞GTG突变而成的血红蛋白S（hemoglobin S，HbS）导致的［1］。该病的纯合子表型能够导致胎儿死产或成年前死亡，而杂合子表型能导致贫血、感染合并症、慢性器官损害等一系列并发症［2－3］。全世界每年大约有30万的新生儿受到镰刀形红细胞病的影响，其中75％的病例发生在撒哈拉沙漠以南的非洲地区［1，4］。对于镰刀红细胞贫血，目前只能依靠长期输血治疗，此外就是应用基因诊断技术进行产前诊断，降低人群的发病率［5］。

比奥科岛（Bioko Island），是一个位于非洲几内亚湾中的岛屿。该岛距尼日利亚南部海岸约100公里，在非洲西部大陆赤道几内亚西北160公里处，是赤道几内亚共和国的首都马拉博（Malabo）的所在地。全岛有居民26万人，疟疾感染率高达29.8％。该国的医疗卫生水平低，人民生活条件差，是疟疾和镰刀形红细胞病的高度流行区和高发地区，由于当地落后的经济和技术，目前没有任何镰刀形红细胞病的流行病学的数据。

自1971年开始，广东省承派援助赤道几内医疗队帮助当地居民治疗疟疾及其他基础疾病。因此，我们在马拉博地区医院的支持下，对比奥科岛进行了一次联合的流行病学调查，总结如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2013年1月至2013年12月，1 036名比奥科岛的当地居民（年龄：1～84岁，95％的个体为超过18岁的成人），参与了我们的调查，含男性535名，女性501名。在取得马拉博地区医院伦理委员会和患者或其监护人的同意后，在马拉博地区医院检验科用EDTA-K2真空管抽取外周血2 m L，同时用903标本采集滤纸（Whatman-新华公司）制备干血斑，干燥后4℃保存备用。

1.2 仪器及耗材

LightCycle 480II荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司），MJm im i型梯度PCR扩增仪（美国Bio-Rad），微量加样器（德国Eppendorf公司），超净工作台（中国苏州精华设备有限公司），干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司），TGL-20B型和TGL-28C-C型台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂），LightCycle 480II荧光定量PCR仪专用96孔PCR板及封板膜（荷兰Bioplastics公司）。

1.3 红细胞镰变（HbS）试验

按照《全国检验操作规程》［6］第三版进行操作，步骤如下：（1）在清洁载玻片上被检鲜血1滴，然后加20 g／L的偏重亚硫酸钠液1滴混匀；（2）加盖玻片，避免气泡，用凡士林液体石蜡合剂封固，置于37℃温箱；（3）在温育15 m in、30 m in、1 h、2 h及12 h后分别用高倍显微镜观察有无镰状红细胞形成，同时用正常人做对照检查。

1.4 DNA提取

按照本实验室以往文献［7］，用Chelex-100法提取所有红细胞镰变试验筛查阳性者的干血斑样本DNA，步骤如下：首先剪取0.5 cm×0.5 cm血斑，加入500μL蒸馏水，震荡30 s，然后静置半小时以上，然后用13 600 rpm离心4 m in，弃上清；加入160μL的10％浓度的Chelex-100，振荡后用56℃孵育2 h，接着98℃变性8 m in，振荡30 s，13 500 rpm离心1 m in，最后置于冰箱4℃冷却30 m in以上，吸取上清进行PCR扩增。

1.5 高分辨熔解曲线（high-resolution Melting，HRM）分析

根据本实验室以往建立的HRM鉴定HbS的方法［8］，针对导致血红蛋白S的HBB：c.20 A＞T位点，采用如下引物：HRM-S-F：5′-CACCATGG TGCATCTGACTCC-3′；HRM-S-R：5′-CACCAA CT TCATCCACG TTCA-3′。反应体系总体积20 μL，包括0.2μL的HotStat DNA聚合酶（大连宝生物工程公司），4μL的5×PCR buffer（Mg2＋plus），1.6μL的脱氧核苷三磷酸（dNTP，10 mmol／μL），上述引物各1μL（5μmol／μL），9.2 μL的双蒸灭菌水，1μL的LC GreenⅠ染料（北京思博全）和2μL模板DNA。PCR扩增及熔解曲线分析均在LightCycle 480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行，PCR扩增参数如下：预变性95℃3 m in；扩增98℃10 s，68℃15 s共45个循环。熔解曲线鉴定程序如下：95℃1 m in，40℃1 m in，熔解曲线数据收集从60℃至95℃，温度上升为1℃／s，且每升高1℃进行25次的数据采集，最终采用LightCycle 480Ⅱ软件对进行分析。

1.6 PCR-DNA测序

对于HRM鉴定为HbS突变的样本，用PCRDNA测序进一步确认。采用本实验以往建立的β珠蛋白基因测序引物［9］，扩增体系为为25μL，包括2μL模板DNA，12.5μL PCR混合M ix（北京艾德来），上下游引物各1μL，纯净水8.5μL。扩增后用以2％的琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定，然后纯化后用ABI3730双向测序，查找突变点。

1.7 统计学分析

采用IBM＠SPSS 16.0软件进行统计学分析。按Hardy-Weinberg平衡公式，当P＜0.05时，说明群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔遗传群体。

2 结果

在1 036名参加筛查的比奥科岛居民中，高达16.99％（176／1 036）的样本的红细胞镰变试验筛查阳性，如图1所示，绝大多数阳性的血样在60 m in以后镰变现象就变得明显，只有1例1周岁以下的婴儿的60 m in的镰变现象不太明显，但24 h时依然可以观察到一定比例的镰刀形红细胞。我们认为，这应该是该婴儿的血液里面还有较多含量的HbF，因此降低了HbS的比例，使红细胞镰变的现象减弱。

图1 红细胞镰变（HbS）试验检测结果Figure 1 The results of sickle solubility test

所有的筛查阳性结果，均用高分辨熔解曲线（图2）和PCR-DNA测序分析（图3）。我们发现镰刀形红细胞病杂合子表型（c.20 A＞T杂合子）的曲线很容易和正常人（野生型）曲线区分。176例样本通过HRM和PCR-DNA测序法均鉴定为镰刀型红细胞病杂合子，基因频率为16.99％（176／1 036），2种方法的符合率100％。由于我们的样本绝大多数采集自岛上的成人，而且镰刀形红细胞病患者的纯合子在胎儿时就死产或成年前死亡，因此数据不能符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝8.927，P＝0.002）。

图2 高分辨熔解曲线分析结果Figure 2 The results of HRM assay and PCR-DNA sequencing

图3 PCR-DNA测序结果Figure 3 The results of PCR-DNA sequencing

3 讨论

镰刀形红细胞病是世界上危害最为严重的一种单基因遗传病，纯合子表型能够导致胎儿的死产或需要长期输血才能存活；杂合子表型导致患者体内的红细胞容易破坏且堵塞血管，会造成局部缺血、贫血、感染合并症、慢性器官损害等一系列并发症使患者的寿命缩短到40岁左右［2－3］。与非洲中部报道的10％至40％的发生率一致［10－12］，比奥科岛居民镰刀形红细胞病发生率也高达16.99％。基于这个调查数据，按照Hardy-Weinberg平衡公式进行估算，即在本岛26万居民之中大约有4万人的杂合子着存在，同时也造成每250个妇女怀孕就会产生1个纯合子，给当地居民的健康和社会经济造成严重的影响。赤道几内亚是一个发展中国家，缺乏足够的人力和物力进行流行病学的调查，本研究提供了比奥科岛镰刀形红细胞病的流行病学资料，为比奥科岛当地的卫生部门制定镰刀形红细胞病防控政策提供了参考。

传统的镰刀红细胞病诊断方法，包括红细胞镰变试验、血红蛋白电泳、AMRS-PCR和PCR限制性片段多态性（PCR-RFLP），存在着耗时长、操

作繁琐、PCR产物污染等各种缺陷，不利于大规模的人群筛查。HRM分析是新近发展起来的高效基因检测技术，具有灵敏度高、特异性强、高通量和成本低廉等优点，非常适合单个碱基或几个碱基的变化检测［13］。在我们的研究中发现杂合子DNA能够准确的与野生型DNA区分开来。Chelex-100法提取血斑DNA操作简单，价格便宜，再结合HRM法的优点，合适在非洲地区推广针对镰刀红细胞病进行大规模的人群调查和遗传学研究。

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Epidem iological investigation of the sickle cell disease in local inhabits on Bioko Island,Equatorial Guinea

XIE Dongde1,2,CHEN Jiangtao1,3,Urbano Monsuy Eyi4,Rocio Apicante Matesa4,Maximo M iko Ondo Obono5,Carlos Sala Ehapo5,YUE Liang6,GUO Yihua2,GU Jiechao2,ZHAN Xiaofen6,YANG Hui6,YANG Huitian6,YANG Liye6,LIN M in6★
(1.The Chinese Medical Aid Team to the Republic of Equatorial Guinea,Guangzhou,Guangdong,China, 510000；2.Department of Medical Laboratory Science,Jiangmen People's Hospital,Jiangmen,Guangdong, China,529020；3.Laboratory Medical Center,The Huizhou Central Hospital,Huizhou,Guangdong,China, 516001；4.Central Blood Transfusion Service,Hospital Regional De Malabo,Malabo,The Republic of Equatorial Guinea；5.Department of Medical Laboratory Science,Hospital Regional De Malabo,Malabo, The Republic of Equatorial Guinea；6.Laboratory Medical Center,Chaozhou Central Hospital,Southern Medical University,Chaozhou，Guangdong,China，521021)

Objective To investigate the epidem iological characteristics of the s ickle c ell d isease（SCD）in local inhabits on Bioko Island,Equatorial Guinea.Methods During January 2013 to December 2013,1 036 local inhabits were screened for SCD by sickle solubility test.Then,all the screening positive

Sickle Cell Disease；Bioko Island；H igh-resolution melting assay；PCR-DNA sequencing

中国博士后科学基金（2013M 542195）；国家自然科学基金（81101329）

1.中国第二十六批援赤道几内亚医疗队，广东，广州510000 2.江门市人民医院检验科，广东，江门529020 3.惠州市中心医院医学检验中心，广东，惠州516001 4.赤道几内亚共和国马拉博市马拉博地区医院中心血站，赤道几内亚5.赤道几内亚共和国马拉博市马拉博地区医院医学检验科，赤道几内亚6.潮州市中心医院中心实验室，广东，潮州521021

★通讯作者：林敏，E-mail：konfutea＠hotmail.com

samples were identified by high-resolution melting(HRM)assay and PCR-DNA sequencing.Results The prevalence of SCD in local inhabits on Bioko Island was 16.99％(176/1 036).SCD could all be efficiently identified by HRM analysis，and 100％concordance was found between the HRM analysis and the r PCRDNA sequencing.Conclusion High prevalent SCD on Bioko Island indicated that the local health department and government should make efficiently strategy for the control of SCD in the region.HRM assay is a rapid,low-cost,accurate and high-throughput method to screen for SCD which is worthy to promote its use in high-prone areas of SCD in A frica.