酸性环境对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制研究

张俊霞 徐金升 冯雨 白亚玲 张胜雷 崔立文 张慧然

心血管疾病是慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）患者死亡的重要原因，据统计50%以上的CKD患者死于心血管疾病［1］。血管钙化与CKD患者心血管疾病的发生密切相关，其防治已成为肾脏科医生关注的焦点。研究表明，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型转化是发生血管钙化的重要环节［2］。慢性代谢性酸中毒是CKD患者的一种常见并发症［3］，近期Leibrock等［4］研究发现代谢性酸中毒可以抑制VSMCs表型转化。本课题组前期研究发现，维生素K［5］、γ干扰素［6］、镁离子［7］均可抑制 VSMCs 表型转化的发生。然而，酸性环境对VSMCs表型转化的作用机制尚未清楚，故本实验探讨了酸性环境对高磷诱导大鼠VSMCs钙化的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 5～8周龄健康雄性SD大鼠6只，体重80～100 g，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证标号：1305090。

1.1.2 主要试剂和仪器 倒置相差显微镜（LH50A型）（日本 OLYMPUS公司）；酶标仪（CYTATION3型）（美国 Biotek公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美国 GIBCO 公司）；DMEM 培养基（美国GIBCO公司）；SP免疫组化试剂盒（河北博海生物工程开发有限公司）；酸度计（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；钙含量测定试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（河北博海生物工程公司）；RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒（美国Therom公司）；PCR引物（上海英潍捷基公司）；钙离子探针Fluo-3/AM（美国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMCs的原代培养及实验分组 贴壁法原代细胞培养［5］，将VSMCs按随机数字表法分为正常对照组和高磷干预组。正常对照组采用含10%胎牛血清培养基；高磷干预组采用高磷培养基（含 10 mmol/L β-甘油磷酸）培养，再分别加入1 mol/L盐酸调整 pH值为6.8、7.1和7.4，每24 h换液1次。一般认为酸性环境培养细胞时间＞12 h即为细胞受到慢性酸中毒的刺激［8］，本研究所取时间点为4 d和14 d，为研究酸性环境对VSMCs钙化的长期影响提供保证。

1.2.2 细胞鉴定 按文献［7］方法进行细胞鉴定，传代纯化，细胞生长特性未见异常改变。

1.2.3 钙化检测 钙含量测定 细胞培养14 d后弃去上清液，PBS洗3次，加入1 mol/L盐酸脱钙24 h，取上清液采用邻甲酚酞络合酮比色法检测细胞钙化情况［6］。每组设3个复孔，取平均值。

茜素红染色 细胞培养14 d后用细胞茜素红钙染色试剂对样本进行固定、染色及澄清处理，倒置显微镜下观察钙结节染色情况，每组选取3个样本，每个样本按随机数字表法选取1个视野（×100）。SDS结果判断标准：钙盐沉积为橘红色。

1.2.4 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性测定 细胞培养14 d弃上清，PBS洗3次，0.1%Triton X-100置4℃环境中过夜，采用酶联免疫吸附法测定ALP活性［6］，每组实验重复3次。

1.2.5 VSMCs内钙离子浓度测定 钙离子可以和荧光探针Fluo-3/AM结合后，被325 nm激光激发，发射出526 nm荧光，荧光强度可以反映出细胞内钙离子水平。按文献［9］方法，根据本课题组前期预实验结果，细胞刺激4 d，检测VSMCs内钙离子浓度。于孔板上培养细胞，胰酶消化细胞收集于离心管内，离心1 000转，5 min，弃上清；冷PBS洗涤细胞后，离心1 000转，5 min，弃上清；含钙 HEPES缓冲液洗涤细胞，重悬细胞，调整细胞浓度为200～300×106/L，Fluo-3/AM加入至细胞悬液当中，终浓度为 5 μmol/L，37℃避光负载 35 min；以 80 mmol/L钾溶液为激动剂，细胞悬液置于孔板内，每组均设置对照孔，使用酶标仪检测，激发光波长为325 nm，于526 nm处检测荧光值，实验重复3次，取平均值。

1.2.6 观察酸性环境对大鼠VSMCs中目的基因表达的影响 通过预实验摸索，我们发现细胞接受4 d干预后，目的基因表达较为稳定。采用RNA分离试剂盒Trizol提取并纯化组织总RNA。PCR反应在ABI5700型PCR仪上进行，反应程序为：95℃预变性 5 min， 95℃ 变性 30 s，LTCCα1C58℃、LTCCβ250℃、LTCCβ358℃和GAPDH 58℃退火30 s，72℃延伸 45 s，32 个循环；Smad1 55℃退火、72℃延伸 45 s，36个循环；Runx2 55℃退火、72℃延伸45 s，28个循环，最后于72℃延伸10 min。取PCR产物，行琼脂糖凝胶电泳。应用RT-PCR方法进行检测。实验重复3次，取平均值，以GAPDH作为内对照，计算相对含量。各基因扩增引物序列见表1。

表1 各目的基因引物序列

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，符合正态分布的计量资料用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），用LSD-t检验作多组间均数两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酸性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs钙化影响

茜素红染色结果显示，与正常对照组相比，高磷+pH7.4组橘红色钙化结节明显增多，且高磷组随pH降低橘红色钙化结节明显减少（图1）。4组大鼠VSMCs钙含量比较，差异有统计学意义（F=65.29，P＜0.01）；与正常对照组相比，高磷+pH7.4组钙含量明显增多（P=0.011），且高磷组随pH降低钙含量明显减少（均为P＜0.05）（表2）。

2.2 酸性环境对Runx2 mRNA表达和ALP活性的影响

4组大鼠VSMCs的Runx2 mRNA比较，差异有统计学意义（F=1 234.839，P ＜0.01）；与正常对照组相比，高磷+pH7.4组Runx2 mRNA表达水平增加（P＜0.01），且高磷组随着 pH值降低 Runx2 mRNA 表达量下降（P ＜0.01）（图2，表3）。

图1 各组大鼠VSMCs钙化结果（茜素红染色，×100）

表2 各组大鼠VSMCs钙含量、ALP活性及钙离子浓度比较（±s）

表2 各组大鼠VSMCs钙含量、ALP活性及钙离子浓度比较（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与高磷+pH6.8组比较，bP＜0.05；与高磷+pH7.1组比较，cP＜0.05

组别 n 钙含量（mg/g蛋白） ALP活性（U/g蛋白） 钙离子浓度（Fluo-3/AM）正常对照组 3 22.39±3.19 20.39±1.18 149.54±20.89高磷+pH6.8组 3 50.74±3.29a 34.62±1.13a 234.00±17.43a高磷+pH7.1组 3 69.95±1.72ab 51.11±2.05ab 329.66±16.64ab高磷+pH7.4组 3 88.26±6.43abc 94.33±3.08abc 438.33± 7.50abc

表3 各组大鼠VSMCs目的基因表达水平比较（±s）

表3 各组大鼠VSMCs目的基因表达水平比较（±s）

注：与正常对照组比较，aP＜0.05；与高磷+pH6.8组比较，bP＜0.05；与高磷+pH7.1组比较，cP＜0.05

组别 n LTCCα1C亚基 LTCCβ2亚基 LTCCβ3亚基 Runx2 Smad1正常对照组 3 0.66±0.04 0.36±0.02 0.34±0.13 0.01±0.00 0.07±0.01高磷+pH6.8组 3 0.65±0.05 0.38±0.02 0.43±0.01a 0.09±0.01a 0.23±0.01a高磷+pH7.1组 3 0.65±0.04 0.36±0.03 0.64±0.11ab 0.25±0.02ab 0.44±0.04ab高磷+pH7.4组 3 0.64±0.03 0.36±0.02 0.80±0.01abc 0.37±0.02abc 0.65±0.05abc

图2 各组大鼠VSMCs目的基因表达情况

4组大鼠VSMCs ALP活性比较，差异有统计学意义（F=6.282 6，P=0.02）；与正常对照组相比，高磷+pH7.4组ALP活性明显增加（P＜0.01），且高磷组随pH降低ALP活性明显减少（均为P＜0.01）（表 2）。

图3 各组大鼠VSMCs钙离子浓度（Fluo-3/AM，×10）

2.3 酸性环境对高磷诱导的大鼠VSMCs的LTCCα1C、β2和 β3亚基 mRNA 表达的影响

4组大鼠VSMCs的LTCCβ3亚基mRNA比较，差异有统计学意义（F=370.275，P＜0.01）；与正常对照组相比，高磷 +pH7.4组 LTCCβ3亚基mRNA表达水平增加（P＜0.01），且高磷组随着pH值降低LTCCβ3亚基mRNA表达量下降（均为P＜0.01）；各组之间 LTCCα1C和 β2亚基 mRNA的表达差异无统计学意义（P=0.08，P=0.74）（图 2，表3）。

2.4 酸性环境对VSMCs胞外钙离子内流效应的影响和Smad1 mRNA表达的影响

荧光显色结果显示，与正常对照组相比，高磷+pH7.4组VSMCs钙离子浓度明显增加，且高磷组随pH降低胞内钙离子浓度下降（图3）。4组大鼠VSMCs Fluo-3/AM荧光强度比较，差异有统计学意义（F=305.395，P ＜0.01），与正常对照组相比，高磷+pH7.4组VSMCs钙离子浓度明显增加（P＜0.01），且高磷组随pH降低胞内钙离子浓度下降（均为P＜0.01）（表2）。4组大鼠VSMCs的 Smad1 mRNA比较，差异有统计学意义（F=591.948 9，P＜0.01）；与正常对照组相比，高磷+pH7.4组Smad1 mRNA表达水平增加（P＜0.01），且高磷组随着pH值降低Smad1 mRNA表达量下降（均为P＜0.01）（图2，表3）。

3 讨论

CKD患者是心血管疾病的高危人群，而血管钙化是心血管疾病的重要危险因素，不同于普通人群发生的动脉粥样硬化，CKD患者以血管中膜钙化为突出表现［2］。VSMCs作为血管中膜的重要成分，在血管钙化发生过程中起重要作用。钙通道、细胞质中的钙和肌浆网储存的钙构成了VSMCs的钙信号通路。由钙通道介导的钙离子内流可以通过促进细胞凋亡，加速基质小泡释放，促进钙磷沉积等多种机制来参与血管钙化的发生、发展［10］。LTCC作为钙通道中重要一员，参与VSMCs的基因转录、表型转化等生物学过程［11］。代谢性酸中毒是CKD患者的常见并发症，近年来就酸性环境对骨形成的作用研究较为深入，然而其对血管钙化作用的研究甚少。我们已知VSMCs成骨/成软骨表型转化是其重要机制之一［9］，据此，可将酸性环境对成骨作用的影响推演到血管钙化上。我们通过体外培养VSMCs，深入探讨酸性环境对VSMCs钙化的影响。在前期预实验当中，我们调整高磷组培养基pH从6.5开始，每组相差 0.1，终到 7.4，MTT实验显示细胞在pH6.5到pH7.4的培养基当中均生长良好，为放大造模效应，更好地说明慢性酸负荷对高磷诱导的VSMCs钙化的影响，选取pH6.8及pH7.1两个pH值为实验组。本研究中茜素红钙化染色结果同钙含量结果基本一致，均提示酸性环境可以抑制高磷诱导的VSMCs钙化。

血管钙化常伴随着Runx2、ALP等骨相关蛋白的表达。作为成骨细胞分化的特异性标志物Runx2，亦是VSMCs表型转化的标志［2］。 本研究发现酸性环境可以抑制高磷诱导的VSMCs的Runx2表达，并随着pH降低，Runx2表达减少，提示酸性环境在VSMCs表型转化过程中起着重要作用。另一方面，ALP是血管平滑肌成骨表型转化的早期标志物［2］，本研究发现，高磷组ALP活性较正常对照组均有所增加，且高磷组ALP随着pH值降低活性下降，进一步验证了酸性环境可以抑制VSMCs表型转化的发生。

LTCC是VSMCs上重要的电压门控钙通道，目前已知α1C、β2和β33种亚基在VSMCs上表达，它具有高电压活化，开放时间长及失活慢的特点，是介导钙离子内流入VSMCs的主要途径，LTCCβ3亚基位于细胞膜内侧，它与α1C亚基共表达可提高LTCC激活阈值和峰电位，也可增加LTCC在胞膜上的密度［12］。 Dawson 等［13］研究表明，上调 LTCCβ3亚基表达可以显著增加钙离子内流入细胞。本研究结果显示，高磷组VSMCs的LTCCβ3亚基mRNA表达水平降低后VSMCs钙离子浓度相应减少，这提示我们酸性环境可能通过下调LTCCβ3亚基的表达抑制了钙离子内流。钙离子作为VSMCs重要的第二信使，除直接参与生命活动外，同样需要相应蛋白将钙离子下游信号传递到不同的信号网络。Eapen等［14］研究表明，细胞外钙离子内流入细胞后，可以通过调控胞内的信号分子Smad1的丝氨酸磷酸化，Smad蛋白活化后转位至胞核内进而调控其下游目的基因转录，上调Runx2的表达。因此我们进一步研究了酸性环境对Smad1及Runx2 mRNA表达的影响。本实验中发现，高磷组Smad1及Runx2 mRNA表达水平均有不同程度增加，且随着pH值的下降，Smad1及Runx2 mRNA表达量逐渐减少。因此，推测酸性环境抑制VSMCs表型转化和钙化的可能机制是通过降低LTCCβ3亚基表达来阻滞钙离子内流，进一步抑制Smad1和Runx2的表达从而抑制VSMCs表型转化来实现的。

本研究发现酸性环境可以抑制高磷诱导的大鼠VSMCs钙化，其可能机制是通过抑制LTCCβ3亚基表达，降低VSMCs钙离子内流，阻滞VSMCs发生表型转化来实现对VSMCs钙化的抑制作用。这为我们临床治疗血管钙化提供了新思路。本实验仅在基因水平上发现酸性环境抑制LTCCβ3亚基基因表达，有待进一步在蛋白水平上证明LTCCβ3亚基的变化。酸性环境对LTCCβ3亚基基因表达的影响是通过减少了基因转录水平亦或是增加了mRNA降解，其具体作用机制笔者将会进行深入探讨。