亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考胺的残留量

刘正才，张 琼，杨 方，林永辉，刘素珍，苏芝娇

（福建出入境检验检疫局 福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建 福州 350001）

亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考胺的残留量

刘正才，张 琼，杨 方，林永辉，刘素珍，苏芝娇

（福建出入境检验检疫局 福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建 福州 350001）

建立亲水作用色谱-电喷雾串联质谱测定水产品中氟苯尼考胺残留量的测定方法。样品用碱性乙酸乙酯提取，以正己烷和脂肪吸附材料去除油脂，用5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸）和乙腈作为流动相，以梯度洗脱方式在Acquity UPLC BEH HILIC柱（55 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱上分离，以电喷雾离子源正离子模式进行质谱分析，基质外标法定量。结果表明，氟苯尼考胺的质量浓度在0.1～20 ☒g/L范围内呈良好的线性，相关系数（r2）大于0.990。在1.0 ～50.0 ☒g/kg加标水平下，虾、黄鱼、鳗鱼、烤鳗的平均回收率为70.5%～87.7%，相对标准偏差为4.8 %～11.6%，定量限为1.0 ☒g/kg。该方法简单、灵敏、稳定，可满足水产品中氟苯尼考胺残留量的检测和确证需要。

亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法；水产品；氟苯尼考胺；残留检测

氟苯尼考胺（florfenicol amine，FFA）是一种氯霉素类抗生素药物氟苯尼考（florfenicol，FF）的主要代谢产物[1-2]，随着FF在水产养殖上大量、不规范应用，它在水产品中的抗药性和残留问题也日益被重视，影响水产品质量安全[3-4]，因此，中国、欧盟及美国均对水产品中FF的最大残留量（100 ☒g/kg）进行了规定并以FF和FFA的浓度之和作为标示残留物[5]。目前对FF的检测比较成熟[4-12]，我国也发布了相关的检测标准[13-16]，而单独对其代谢物FFA的研究较少。

目前有文献报道的检测方法多为酶联免疫法[7]、毛细管电泳法[8]、高效液相色谱法[9-11]、气相色谱-质谱法[12,17]、液相色谱-质谱法[18-20]等；酶联免疫法为定性方法，不能准确定量；高效液相色谱法具有简单快速的特点，较难满足国内外对FFA的残留限量要求；气相色谱-质谱法虽然灵敏度较高，可以满足检测要求，但需要对样品进行衍生，方法繁琐，干扰多；文献[12,17-18]采用液相色谱-质谱法需要采用不同的电离模式，而正负离子切换模式会使灵敏度降低，并且都较少对基质效应进行考察，另外，国家标准[16]以及文献[10,18-20]报道的方法对FFA分离主要采用以C8和C18为固定相的色谱柱，对极性较强的FFA保留能力差，存在拖尾等缺点。因此，研究检测水产品中的FFA残留量的检测方法是十分必要的。亲水作用色谱（hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）法分离强极性化合物是近年来色谱研究的热点领域之一[21-23]。HILIC能有效地解决强极性化合物在反相色谱中保留弱或难以保留的问题，而且易于实现与质谱的联用，近年来广泛应用于极性化合物、离子型、碱性化合物的分离。本研究是在标准方法[16]的基础上进行改进，利用FFA的碱性离子型化合物特性，结合亲水相互作用液相色谱技术，建立了快速简便、高效准确地测定水产品中FFA的液相色谱-串联质谱方法，方法操作简便、灵敏度优于文献[18,20]报道，满足中国、欧盟、美国等对氟苯尼考残胺留限量检测的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验用鳗鱼、虾、黄鱼购自于福州水产品市场；烤鳗 送检样品。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵（均为色谱纯） 德国默克公司；其余试剂为分析纯，水为去离子水；氟苯尼考胺标准品（纯度≥99.0%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司；LAS脂肪吸附材料（粒径60 μm） 大连思谱精工有限公司。

1.2 仪器与设备

Ultra performance LC/Quattra Premier超高效液相色谱-串联质谱联用仪（配电喷雾电离源） 美国Waters公司；TDL-40B低速台式离心机 厦门精艺兴业科技有限公司；HN200多功能氮吹仪 海能仪器公司；去离子水发生器 美国Milli-Q公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

氟苯尼考胺标准储备液（100 μg/mL）：称取经折算相当于10 mg（精确到0.01 mg）的标准物质，用水溶解后以甲醇定容至100 mL容量瓶中。置于具塞试剂瓶中于－4 ℃冷藏保存。标准工作液：用阴性样品提取液稀释氟苯尼考胺储备液，分别配成氟苯尼考胺质量浓度为0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ng/mL的标准工作液，该工作液在4 ℃条件下可保存2 周。

1.3.2 样品制备

虾去壳后取可食部分、鳗鱼去皮和骨后取肌肉部分，搅成匀浆；烤鳗先用水洗去外面的酱油等添加物，然后取肌肉部分，搅成匀浆，于－18 ℃冷冻保存。

1.3.3 提取

称取试样5 g（精确到0.1 g）于50 mL具塞塑料离心管中；其余提取步骤参见标准GB/T 22959—2008《河豚鱼、鳗鱼和烤鳗中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定：液相色谱-串联质谱法》[16]，以含氨水乙酸乙酯混合溶液（3∶97，V/V）提取，定容至50 mL容量瓶中，分取10.0 mL乙酸乙酯，于45 ℃减压旋转浓缩至干。

1.3.4 净化

加入2.00 mL 水溶解玻璃离心管中氮吹后的残渣，旋涡振荡混匀，超声波功率100 W超声5 min，加入3 mL正己烷旋涡振荡混合30 s，4 500 r/min离心3min后用一次性吸管移去上层的正己烷，再加入2.00 mL乙腈和0.2 g LAS脂肪吸附材料，旋涡振荡混匀30 s后取上清液过0.2 μm水性滤膜至样品瓶中供液相色谱-串联质谱测定。

1.3.5 仪器参数与测定条件

液相色谱条件：色谱柱：Acquity UPLC BEH HILIC柱（55 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流动相A：5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%）甲酸，B：乙腈，流速0.30 mL/min。梯度洗脱：0～2 min，流动相A由5%线性增至20%；2～2.5 min，由20%线性增至90%，3 min时线性降至5%并保持至5 min；柱温：室温；进样量：5 μL。

质谱条件：电喷雾电离源；正离子扫描；离子源温度：450 ℃；锥孔电压：18 V；扫描方式：多离子反应监测；母离子m/z 248.5；定量离子m/z 230.2，碰撞能量13 eV；定性离子m/z 130.2，碰撞能量20 eV。

液相色谱-串联质谱测定：将FFA基质标准工作溶液在设定条件下分别进样，以定量离子峰面积y为纵坐标，FFA含量（ng/mL）为横坐标x，绘制标准工作曲线。用该标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中FFA的响应值应均在仪器测定的线性范围内。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

氟苯尼考胺含氮基，在ESI源中很容易得到其带一个正电荷的母离子（m/z 248，[M+H]），碰撞分裂后，产生2 个特征定性离子（m/z 230，[M+H—H2O]）、m/z 130，[M+H—H2O—HF—（HSO2-CH3）]。其中m/z 230 丰度值大，受杂质干扰小，选做定量离子。

2.2 液相色谱条件的优化

氟苯尼考胺为碱性化合物，极性较强，普通的C18色谱柱不容易保留，采用液相色谱分析法通需要在流动相中添加离子对试剂，但不能与质谱联用。HILIC以亲水性的硅胶键合相、极性聚合物填料或离子交换吸附剂为固定相，兼有反相色谱和离子色谱的双重特性，对在反相色谱柱上无保留的强极性化合物有较好的保留作用。采用HILIC亲水作用色谱柱对FFA进行分离，对流动相进行梯度洗脱实验发现，流动相的起始比例有机相如果高于30%，FFA峰形反而变宽，相应值变小，这与经典的HILIC分离模式相反，可能由于FFA在酸性溶液中以离子型态存在，高有机相会抑制FFA离子的形成。本方法采用Acquity UPLC BEH HILIC亲水作用色谱柱，以5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸）和乙腈作为流动相，可以得到较好的分离，氟苯尼考胺的保留时间为2.30 min。

2.3 提取与净化条件的优化

氟苯尼考胺微溶于水，在碱性条件下溶于有机溶剂，实验用65%乙腈、46%丙酮、94%乙酸乙酯、75%二氯甲烷等有机溶剂同时提取作比较，发现乙酸乙酯的提取效率最好，因此选用碱性乙酸乙酯进行超声振荡提取。采用乙酸乙酯对水产品提取时，有大量的油类、脂质及类脂质同时被提取出来，尤其是鳗鱼和烤鳗，需去除这类脂溶性杂质。目前文献[12,17-18]报道的主要是用正己烷和阳离子交换性质的SPE进行净化，实验发现即使采用正己烷进行多次净化也不能完全除去油脂类杂质，在质谱分析中依然有较大的基体抑制；而采用SPE净化则过程复杂，且成本较高。文献[24]报道强疏水性材料LAS对蛋白和脂肪都有较强的吸附性，本实验以纯水进行复溶解，先用3 mL正己烷除去非极性的油脂杂质，然后加入等量的乙腈稀释后再用0.2 g LAS材料吸附蛋白和脂肪类有机杂质，可以获得满意的结果。

2.4 基质效应的考察

图1 氟苯尼考胺在不同基质的基质校正曲线Fig.1 Matrix extract calibrations of FFA in different matrixes

实验中发现，对所验证的基质样品，使用溶剂校正曲线校正加标结果时，回收率都为30%～50%左右，即使用空白基质溶液稀释标准溶液，响应值也会降低很多，说明存在较为严重的基质抑制效应。对其进行基质效应的考察，基质抑制效应采用（基质匹配标准溶液所作曲线的斜率/无基质标准溶液所作曲线的斜率—1）×100进行评价[25]，分别对基质匹配曲线和溶剂（10%乙腈溶液）匹配曲线作图（图1）。可以看出，如果不进行LAS材料净化处理而只用正己烷简单的除脂，黄鱼（—30.4%）、虾（—39.9%）、鳗鱼（—50.5%）、烤鳗（—68.5%）4 种基质存在非常明显的基质抑制效应，而加入乙腈稀释定容液再加入LAS材料净化后，基质效应分别为黄鱼—10.8%、虾—12.6%、鳗鱼—24.5%、烤鳗—27.2%。由于没有相应的同位素内标，本方法通过稀释样品溶液和基质匹配标准溶液校准方法来消除基质效应的影响。

2.5 线性方程、检出限、定量限

在本方法所确定的实验条件下，4 种基质样品的基质校正曲线的线性方程、相关系数如表1所示。根据仪器的信噪比RSN不小于3时的相应值，结合方法的前处理过程，本方法的检出限为0.5 ☒g/kg；按照RSN不小于10时的相应值计算定量限，本方法的定量限为1.0 ☒g/kg。

表1 线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限Table1 Linear equations, correlation coefficients (Table1 Linear equations, correlation coefficients (r2), limits ofof detection (LOD) and limits of quantification (LOQ) detection (LOD) and limits of quantification (LOQ)

2.6 方法回收率和精密度

表2 虾、黄鱼、鳗鱼、烤鳗基质中FFA在4个添加水平下的平均回收率以及精密度（n=6）=6Table2 Average recoveries and relative standard deviations of FFA at Table 2 Average recoveries and relative standard deviations of FFA at four spiked levels in shrimp, yellow croaker, eel, and eel product ( four spiked levels in shrimp, yellow croaker, eel, and eel product (n = 6) = 6)

图2 不同空白样品以及加标水平为1.0 ☒g/kg样品中FFA的MRM色谱图Fig.2 Chromatograms of (a) blank sample and (b) blank sample spiked with FFA at 1.0 ☒g/kg under MRM mode

以不含氟苯尼考胺的虾、黄鱼、鳗鱼、烤鳗为基质，按照前面的提前净化步骤进行4 个添加水平的添加回收实验，每个样品基体和每个添加水平重复测定6 次，回收率与精密度见表2。由表2可见，4 种添加水平下的平均回收率在70.5%～87.7%之间，相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）在4.8%～11.6%之间。说明方法的准确度高，通用性好，其标准色谱图见图2。

2.7 实际样品的检测

采用本方法对送检本实验室的虾、黄鱼、鳗鱼、烤鳗等样品进行检测，检测共84 个样品，结果显示，4 个烤鳗样品检出氟苯尼考胺，含量为1.0～100 ☒g/kg。

3 结 论

上述结果表明，所建立的亲水作用色谱-电喷雾串联质谱法具有较低的定量限和较好的重复性，该方法简单、快速、操作简单、适用性强，适合于水产品中氟苯尼考胺的日常检测。

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Determination of Florfenicol Amine in Aquatic Products by Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIU Zhengcai, ZHANG Qiong, YANG Fang, LIN Yonghui, LIU Suzhen, SU Zhijiao
(Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)

A method for the determination of florfenicol amine (FFA) in aquatic products was developed by hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (HILIC-MS-MS). Samples were extracted with alkalinified ethyl acetate and cleaned up with n-hexane and lipid adsorbent (LAS). An Acquity UPLC BEH HILIC (55 mm × 2.1 mm, i.d. 1.7 μm) colunm was used for the separation by gradient elution program using acetonitrile-5 mmol/L ammonium acetate containing formic acid (0.2%) as the mobile phase, and an electrospray ion trap mass spectrometer was used in the positive ion mode. The FFA was quantified by the matrix-matched external standard method. The results showed that the established method had a good linear correlation (r2＞ 0.990) in the range of 0.1–20 ☒g/L. The average recoveries of FFA at spiked level of 1.0–50.0 ☒g/kg were in the range of 70.5%–87.7% with relative standard deviations (RSDs) of 4.8%–11.6%. The limit of quantization (LOQ) was 1.0 ☒g/kg. This method proved to be simple, sensitive, accurate, and suitable for the determination and confirmation of FFA in aquatic products.

hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (HILIC-MS-MS); aquatic products; florfenicol amine; residue determination

O657.63

A

1002-6630（2015）04-0198-04

10.7506/spkx1002-6630-201504039

2014-05-11

公益性行业（质检）科研专项（201310143-02）；福建省科技项目（2012Y6001）

刘正才（1977—），男，高级工程师，硕士，研究方向为农兽药残留分析。E-mail：liuzhengcai@gmail.com