响应面分析法优化超声波提取干制红枣中大位阻农药三唑锡工艺

田木星，王伟华*，涂 玲

（塔里木大学生命科学学院，新疆生产建设兵团南疆特色农产品深加工重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

响应面分析法优化超声波提取干制红枣中大位阻农药三唑锡工艺

田木星，王伟华*，涂 玲

（塔里木大学生命科学学院，新疆生产建设兵团南疆特色农产品深加工重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

以干制红枣为材料，研究超声波辅助法提取大位阻农药三唑锡的最佳条件。考察超声提取功率、提取温度、提取时间、料液比及提取次数5 个单因素对三唑锡提取的影响，并在单因素试验的基础上进行响应面分析，得到三唑锡提取的最佳工艺条件为温度45 ℃、频率45 kHz、料液比1∶12（g/mL）、提取6次、提取时间50 min、超声提取功率70 W，经验证，此条件下三唑锡含量为0.15 mg/kg。

超声提取；红枣；三唑锡

新疆因地域辽阔，光热资源丰富，发展特色林果有得天独厚的自然优势，素有“瓜果之乡”的美誉。新疆已形成了南疆环塔里木盆地以红枣、香梨、苹果等 为主的特色林果主产区，果品总产量超过530万 t。尤其是红枣的发展无论从种植面积还是从产量、品质上，都将河南、河北等红枣传统产地甩在了后头。年产值可达150亿 元，为新疆经济的腾飞做出了卓越的贡献[1-2]。在巨大经济利益的驱使下，食品安全隐患依然存在，不容忽视。在种植枣业上，超范围使用农药及非法使用化学品的现象仍较为严重，通过调研了解到，南疆红枣中目前使用的农药多数是针对虫害（螨虫、红蜘蛛、枣瘿蚊等）的，例如：哒螨灵、三唑锡及螨危等，这些农药使用范围广、降解速度慢、残留时间长，严重威胁人们健康[3]。

图1 三唑锡结构Fig.1 Structure of azocyclotin

三唑锡是一种有机锡类的高效、广谱、触杀性杀螨剂，结构见图1，其化学名称为三（环己基）-1H-1,2,4-三唑-1-基锡[4-6]。国际食品法典委员会规定三唑锡的最高残留限量为0.1 mg/kg，GB 2763—2005《食品中农药最大残留限量》规定水果中的最高残留限量为2.0 mg/kg，法国规定为0.20 mg/kg，国际食品法典委员会规定为0.1 mg/kg，日本2006年开始实施的“肯定列表制度”规定所有食品中均不得检出三唑锡[7-12]。

三唑锡具有亚急性和慢性毒性、致敏性、致突变性、致畸性及致癌性。三唑锡对环境危害较大，摄入或与皮肤接触可引起中毒[13-14]。

本实验以红枣中使用面广且危害较大的农药三唑锡为研究对象，考察提取时间、提取温度、提取次数、超声提取功率及料液比5 个单因素对其提取工艺的影响，采用响应面法[15-16]，建立回归分析模型，从而确立三唑锡的最佳提取条件，为建立该农药快速检测方法提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红枣去核切碎之后于60 ℃恒温干燥，待用。

甲醇、正丁醇、丙酮、氯仿、乙腈等均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1900双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-100VDE双频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；PL2002电子分析天平 梅特勒-托利多集团；GZX-9246MBE数显鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 标准液配制

准确称取三唑锡标准品0.10 g，用甲醇溶解并定容于50 mL的容量瓶中，摇匀，得到0.2%的母液，用双光束紫外-可见分光光度计在190～400 nm波长处进行扫描从而确定三唑锡的最大吸收波长。

1.3.2 标准曲线的测定

先将上述溶液稀释100 倍后，分别取三唑锡标准液0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL于10 mL容量瓶中用甲醇稀释，用双光束紫外-可见分光光度计在213 nm波长处测定吸光度。

1.3.3 提取溶剂的选取

分别称取已处理好的干制红枣2.00 g，在超声提取温度45 ℃、时间30 min、功率70 W、料液比1∶6，提取次数3 次的条件下分别用甲醇、正丁醇、丙酮、氯仿及乙腈进行提取。测定吸光度确定最佳提取溶剂。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 提取次数对超声波提取的影响

称取2.00 g处理好的样品于三角瓶中，在温度50 ℃、时间30 min、频率45 kHz、功率70 W的条件下进行提取，提取次数分别为1、2、3、4、5、6，在3 000 r/min条件下离心20 min，取上清液定容至50 mL，在分光光度计上测其吸光度。

1.3.4.2 提取时间对超声波提取的影响

提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min。称取2.00 g处理好的样品于三角瓶中，按料液比1∶6加入甲醇，温度45 ℃、频率45 kHz、提取功率70 W、提取次数6 次的条件下进行超声提取，在3 000 r/min条件下离心20 min，取上清液定容至50 mL，测量吸光度。

1.3.4.3 提取温度对超声波提取的影响

提取温度分别为25、35、45、55、65 ℃条件下进行提取。称取2.00 g处理好的样品于三角瓶中，按料液比1∶6加入甲醇、时间50 min、频率45 kHz、功率70 W，在超声仪上进行提取，在3 000 r/min条件下离心20 min，取上清液定容至50 mL，在分光光度计上测其吸光度。

1.3.4.4 提取功率对超声波提取的影响

将提取功率设为50、60、70、80、100 W的条件下提取。具体操作方法为：称取2.00 g处理好的样品于三角瓶中，按料液比1∶6加入甲醇，时间50 min、频率45 kHz、提取温度45 ℃在超声提取器上进行提取，在3 000 r/min条件下离心20 min，取上清液定容至50 mL，在213 nm波长处测其吸光度。

1.3.4.5 提取料液比对超声波提取的影响

将料液比设为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的条件下进行提取（即加入甲醇的量为12、16、20、24 mL、28 mL）。称取2.00 g处理好的样品于三角瓶中，设置超声提取器时间50 min、频率45 kHz、提取温度45 ℃、功率70 W条件下进行提取。在3 000 r/min条件下离心20 min，取上清液定容至50 mL，在213 nm波长处测其吸光度。

1.3.5 响应面法的设计

根据SAS9.0中Box-Behnken试验设计原理[17]，根据前期试验选择3 个筛选的关键因素功率、时间、料液比为研究对象，以红枣中提取的三唑锡的吸光度为响应值，进行了三因素三水平的二次响应面回归试验[18-20]（表1）。

表1 响应面分析的因素与水平Table1 Factors and levels used for response surface analysis

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的测定

图2 三唑锡的吸收波长Fig.2 Absorption wavelength of azocyclotin

由图2可知，三唑锡的最大吸收波长为213 nm。

2.2 标准曲线的测定

将配制好的溶液按进行检测，得到标准曲线为y=0.025 5X+0.002 4（R2=0.997）。

2.3 提取溶剂的选取

将超声提取液进行过滤，取上清液1 mL稀释至25 mL，于213 nm波长处测其吸光度。由表2可知，对三唑锡提取最好的有机溶剂为甲醇，故后期实验中选用甲醇作为三唑锡的提取溶剂。

表2 提取溶剂的影响Table2 Effect of extraction solvent type on the extraction rate of azocyclotin

2.4 单因素试验

图3 不同因素对三唑锡提取的影响Fig.3 Effects of different factors on the extraction rate of azocyclotin

由图3a可知，提取次数越多提取的总量越大，但也不是无限增大，当提取近乎完全时，无需再增加提取次数。实验证明提取5 次和6 次最高，且二者之间没有显著差异。提取次数到达5～6 次时，提取量增加不明显，因此可以把第6次提取出的质量看作2.00 g枣中的三唑锡的总质量，故根据标准曲线公式可以得出2.00 g中总的三唑锡的量为0.3 mg。

由图3b可知，提取时间越长，所提取的三唑锡的量就越高，且变化较平缓。结果表明，一次的提取时间为50 min和60 min时是最佳水平，且二者之间无显著差异。故为了节省能耗，选择50 min作为提取时间。

由图3c可知，45 ℃条件下提取的三唑锡是最多的，这可能是由于高温有利于提取，但也不是随着温度的升高而增大的。因为温度越高甲醇越容易挥发，因此选用45 ℃进行提取。

由图3d可知，功率大于70 W的各处理的三唑锡提取量无显著差异，这说明并不是功率越大越好，当功率达到一定值时，有可能影响到三唑锡的结构和形状，故而提取出的三唑锡的量有所下降。

由图3e可知，提取溶剂比例越大，达到饱和时能提取的三唑锡也越多。因此，随着提取溶剂增加，所提取的三唑锡也是逐渐增加的。结果表明料液比1∶12和1∶14是最好的水平，两者间无显著差异。但是从节省溶剂考虑，可以选取料液比为1∶12。

2.5 响应面试验结果

在单因素试验结果上，以X1、X2、X3为自变量，以三唑锡的吸光度为响应值，进行响应面分析试验，结果见表3。

表3 响应面试验分析方案及结果Table3 Program and experimental results for response surface analysis

表3中试验1～12为析因试验，13～15为中心试验。15 个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点试验重复3 次，用以估计试验误差。采用SAS RSREG程序对所得数据进行方差分析，分析结果见表4，3 个因素经过拟合得到如下方程：

Y=0.76—1.995X1+0.059X2+15.962X3—0.040X1X2+ 7.981X1X3—0.041X2X3+0.021X12—0.086X22—0.063X32

表4 响应面方差分析结果Table4 ANOVA analysis of response surface model

从表4中SAS RSREG回归分析结果可以知道，方程回归显著。由表4中的P值可知，X2、X22对Y值的影响显著，表明试验因素对响应值不是简单的线性关系，二次项对响应值也有很大的关系，交互作用的影响相对较小。这和模型回归中的线性和二次项影响显著相对应。

2.6 双因素交互作用分析

按回归方程分析进行软件编程计算，得到了交互因素的响应面和等高线图，从而得出2 个影响因素交互作用与响应值之间的关系，从表4和图4可知，其交互作用效应均显著。而料液比与提取时间的作用最为明显。最优点接近于提取功率70 W、提取时间50 min、料液比1∶12这3 个最优工艺参数，经验证，此条件下三唑锡的含量为0.15 mg/kg。

图4 双因素作用的响应面与等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the effects of factors on the extraction rate of azocyclotin

3 结 论

在单因素试验的基础上，将响应面法应用于优化红枣中三唑锡的提取。结果表明，提取时间的一次项和二次项对三唑锡提取率的影响显著。说明提取功率、提取时间和料液比对三唑锡提取率的影响不是简单的线性关系。回归分析和验证实验结果表明，此方法合理可行。得到三唑锡提取的最佳条件为料液比1∶12（g/mL）、提取时间50 min、功率70 W，此条件下测得干制红枣中三唑锡的含量为0.15 mg/kg。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Solvent Extraction Process for Azocyclotin from Dried Jujube by Response Surface Analysis

TIAN Muxing, WANG Weihua*, TU Ling
(Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Deep Processing of Agricultural Products in South Xinjiang, College of Life Science, Tarim University, Alar 843300, China)

The present work was undertaken to investigate optimal conditions for ultrasonic-assisted extraction azocyclotin from dried jujube. The effects of five factors including ultrasonic power, extraction temperature, extraction time, solid-toliquid ratio and extraction number on extraction efficiency were explored using a combination of single factor method and response surface methodology. An extraction temperature of 45 ℃, an ultrasonic frequency of 45 kHz, an ultrasonic power of 70 W and 50 min extractions performed six times with a solid-to-liquid ratio of 1:12 (g/mL) were selected as the optimal extraction conditions. Experiments conducted under these conditions resulted in an extraction rate of 0.15 mg/kg.

ultrasonic-assisted extraction; jujube; azocyclotin

TS207.7

A

1002-6630（2015）04-0058-05

10.7506/spkx1002-6630-201504011

2013-11-10

新疆生产建设兵团博士资金项目（2012BB012）；国家级大学生创新创业训练计划项目（2013107570010）

田木星（1990—），男，硕士研究生，研究方向为食品质量安全。E-mail：937828978@qq.com

*通信作者：王伟华（1977—），女，副教授，博士，研究方向为食品质量安全。E-mail：wangweihua6688@163.com