骏枣多糖提取工艺优化及其抗氧化活性

2015-12-13黎云龙于震宇郜海燕杨海龙

食品科学 2015年4期

黎云龙，于震宇，郜海燕,*，杨海龙，郑铨，李霞

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095；2.浙江省农业科学院食品科学研究所，浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江杭州 310021；3.阿克苏职业技术学院，新疆阿克苏 843000；4.温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035；5.浙江省诸暨市林业局，浙江诸暨 311800；6.阿克苏茂源果业农民专业合作社，新疆阿克苏 843000）

骏枣多糖提取工艺优化及其抗氧化活性

黎云龙1,2，于震宇3，郜海燕1,2,*，杨海龙4，郑铨5，李霞6

研究新疆阿克苏骏枣多糖的提取工艺条件及其抗氧化活性，采用超声波预处理（功率120 W、时间30 min、温度60 ℃）辅助热水提取法提取骏枣多糖，以Box-Behnken试验设计结合响应面分析法优化了提取工艺条件，确定最佳工艺参数为热水提取温度83 ℃、液固比17∶1（mL/g）、提取时间4 h。此优化条件下，骏枣粗多糖得率为9.51%。骏枣粗多糖具有清除自由基的作用，当质量浓度为5.0 mg/mL时，对2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基和1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基的清除率分别达到54.29%和51.43%。

响应面法；骏枣多糖；超声波；抗氧化能力

枣是鼠李科（Rhamnaceae）枣属植物枣树（Zizyphus jujuba Mill.）的果实，具有补中益气、养血生津、调和药效和安神镇痛等功效[1-3]，是传统中药和滋补保健佳品。红枣多糖具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，对提高机体免疫力具有重要作用[4-6]。近年来，对红枣多糖提取工艺的研究日趋增多，包括超声波[2,7-8]、微波[9]、酶解[10]等辅助提取方法，但将这些辅助提取方法作为预处理，再结合传统热水浸提的研究鲜有报道。响应面法相比传统优化方法，考虑了试验随机误差，在小区域内用简单的一次或二次多项式模型拟合复杂、未知的函数关系，优化结果更为准确，计算更为简便，越来越多地被应用于化学工业、生物学、食品学、工程学等多个领域[11]。新疆阿克苏骏枣果大、皮薄肉厚、含糖量高，本实验以阿克苏骏枣为研究对象，采用超声波辅助提取法预处理枣粉，结合热水提取法提取骏枣多糖，应用响应面法优化骏枣多糖提取工艺，以期在尽量节约成本的前提下，为阿克苏骏枣多糖提取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

骏枣产自新疆阿克苏。

蒽酮国药集团化学试剂有限公司；FeSO4杭州双林化工试剂厂；三吡啶三嗪（2,4,6-tris(2-pyridyl)-striazine，TPTZ）、 1,1-二苯基-2-苦基肼基（1,1-dipheny-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）美国Sigma公司。所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

GBC Cintra 404型紫外-可见分光光度计澳大利亚GBC公司；DS-1型高速组织捣碎机上海精科实业有限公司；KQ5200DE型数控超声清洗器昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

将骏枣去核、烘干、粉碎，在索氏抽提器内用石油醚回流脱除部分有色物质、单糖、双糖、低聚糖及部分小分子物质[12]，真空抽滤后，60 ℃烘干，枣粉备用。

1.3.2 多糖含量测定

采用蒽酮-硫酸法[13]。

1.3.3 单因素试验

采用超声波预处理辅助热水提取法提取骏枣多糖：超声波预处理条件为超声功率120 W、超声时间30 min、超声温度60 ℃，提取溶剂为蒸馏水；之后采用热水提取法，依次对提取温度、液固比和提取时间进行单因素试验。

固定液固比20∶1（mL/g）、提取时间3 h，改变提取温度（50、60、70、80、90 ℃）提取骏枣多糖，进行提取温度单因素试验；固定提取温度60℃、提取时间为4 h，改变液固比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g））提取骏枣多糖，进行液固比单因素试验；固定提取温度60 ℃、液固比20∶1（mL/g），改变提取时间（1、2、3、4、5 h）提取骏枣多糖，进行提取时间单因素试验。

1.3.4 响应面试验设计与分析

选择提取温度（A）、液固比（B）和提取时间（C）为主要因素，在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件设计三因素三水平响应面试验，并对试验结果进行回归和优化。

1.3.5 骏枣多糖脱色脱蛋白

将多糖提取液离心15 min，上清液浓缩后，加入95%乙醇沉淀多糖，静置12 h后抽滤，得到的沉淀依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤，洗涤后的沉淀于40 ℃条件下干燥，得到骏枣粗多糖。

将上述得到的骏枣粗多糖加水溶解，60℃条件下用活性炭粉水浴脱色4 h。加入25 mL Sevag试剂（氯仿和正丁醇体积比4∶1），振荡，静置分层后弃去下层清液及中间夹杂的变性蛋白，重复4 次。再用95%乙醇沉淀多糖，4 ℃冰箱静置12 h后抽滤，依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤沉淀，洗涤后的沉淀于40 ℃条件下真空干燥，得到脱色脱蛋白骏枣多糖。

1.3.6 抗氧化活性的测定

1.3.6.1 铁还原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）测定[14]

取现配的FRAP工作液（0.1 mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L FeCl3溶液）3.9 mL加入0.1 mL适当稀释的待测样品，混匀反应30 min，于593 nm波长处检测10 min，读取吸光度。以FeSO4为标准物绘制标准曲线。待测样品的抗氧化能力以FRAP值表示（1 FRAP单位=1 mmol/L FeSO4）。

1.3.6.2 ABTS＋・清除能力测定[15]

将7 mmol/L的ABTS水溶液与2.45 mmol/L的过硫酸钾水溶液在暗处反应16 h，得到ABTS+・离子液；使用前将离子液在734 nm波长处的吸光度调整为0.700±0.02，30 ℃条件下平衡30 min；取2.0 mL ABTS+・，加入0.2 mL待测样品，室温混匀反应20 min后，于734 nm波长处测定吸光度。清除率计算见式（2）：

式中：A0为空白液吸光度；A1为样品液吸光度。

1.3.6.3 DPPH自由基清除能力测定[16]

取3 mL DPPH（用95%的乙醇配成0.1 mmol/L浓度）溶液，加入2 mL待测样品，室温暗处反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度。清除率计算见式（3）：

式中：A0为空白液吸光度；A1为样品液吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 提取温度对骏枣多糖得率的影响Fig.1 Influence of extraction temperature on the yield of jujube polysaccharides

2.1.1 提取温度对骏枣多糖得率的影响由图1可知，随着提取温度的升高，多糖得率呈先升高再下降的趋势。温度从50 ℃升高到80 ℃过程中，多糖得率不断升高，当提取温度为80 ℃时，多糖得率达到最高；继续升温，多糖得率略微下降，这可能和多糖遇高温分解有关。因此，合理升温有助于多糖的溶出，故选取70、80、90 ℃对骏枣多糖提取作响应面分析，以确定最佳提取温度。

2.1.2 液固比对骏枣多糖得率的影响

图2 液固比对骏枣多糖得率的影响Fig.2 Influence of liquid-to-solid ratio on the yield of jujube polysaccharides

由图2可知，液固比（mL/g）从10∶1增加到15∶1时，多糖得率呈明显上升趋势，从15∶1增加到30∶1时，多糖得率虽略有下降，但变化趋势平稳。综合考虑后续浓缩的需要，选取液固比为10∶1、15∶1、20∶1对骏枣多糖提取作响应面分析，以确定最佳提取液固比。

2.1.3 提取时间对骏枣多糖得率的影响

图3 提取时间对骏枣多糖得率的影响Fig.3 Influence of extraction duration on the yield of jujube polysaccharides

由图3可知，随着提取时间的延长，多糖得率不断升高；但4 h后，延长提取时间对多糖得率提升不明显，综合考虑能源和时间成本，选择3、4、5 h对多糖提取作响应面分析，以确定最佳提取时间。

2.2 响应面试验结果

在单因素试验结果基础上，以提取温度（A）、液固比（B）和提取时间（C）为自变量，以骏枣多糖得率（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0.6设计三因素三水平的Box-Behnken试验，进行响应面分析试验。

表1 Box-Behnken试验设计与结果Table1 Box-Behnken design and results

2.2.1 模型的建立及显著性检验

利用统计软件Design-Expert 8.0.6对表1中试验结果进行多元回归分析，得到骏枣多糖得率的二次模型：

Y=—61.857 72+1.329 14A+1.238 55B+2.774 08C+ 5.300 8×10—4AB+6.552 37AC+0.017 817BC—8.230 96×10—3A2—0.040 227B2—0.418 91C2

用方差分析来评估模型的显著性，如表2所示，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明模型对响应值拟合良好。提取温度（A）的一次项和二次项及液固比（B）的一次项和二次项都达到极显著水平，提取时间（C）的二次项达到显著水平，表明试验因素对响应值不是简单的线性关系。判定系数R2=95.09%，说明95.09%的响应值变化可由方程中的3 个因素解释[17]。该回归方程可较好地描述各因素对骏枣多糖提取效果的影响，可预测在不同提取条件下阿克苏骏枣多糖的得率。在各影响因素中，液固比对多糖得率的影响最大，其次是提取温度和提取时间。

表2 回归方程方差分析表Table2 Variance analysis of regression equation

2.2.2 响应面分析结果

图4 提取温度与液固比对骏枣多糖得率影响的响应面Fig.4 Influence of extraction temperature and liquid-solid ratio on the yield of jujube polysaccharides

图5 提取时间与提取温度对骏枣多糖得率影响的响应面Fig.5 Influence of extraction time and temperature on the yield of jujube polysaccharides

由图4可知，当提取温度一定时，随着液固比的增大，骏枣多糖得率呈现先增加后减少的趋势，这可能是由于增加液固比降低了提取液的黏度，从而削弱了多糖扩散阻力，利于多糖溶出，但过大的液固比会稀释提取液，可能引起后续反应中多糖的损失[18]；当液固比一定时，随提取温度的升高，骏枣多糖得率也呈先升高后降低的趋势，这是因为提高温度有利于枣粉充分吸水溶胀，多糖分子热运动和扩散溶出加剧，但温度过高可能造成多糖降解[19-20]。由图5、6可知，提取时间对多糖得率影响不大，这也与方差分析结果一致，综合考虑能源和时间成本，可以在对优化工艺参数进行调整时，适当减少浸提时间。

图6 液固比与提取时间对骏枣多糖得率影响的响应面Fig.6 Influence of liquid-to-solid ratio and extraction time on the yield of jujube polysaccharides

通过响应面分析，得到骏枣多糖的最佳提取工艺参数为提取温度83℃、液固比17∶1（mL/g）、提取时间4.32 h，理论最佳得率为9.76%。为了检验该参数的可行性，综合考虑实际操作和生产成本后，以提取温度83℃、液固比17∶1（mL/g）、提取时间4 h，进行3次平行验证实验，得到的实际平均得率为9.51%，计算得到标准偏差为0.081 1%，实际得率与理论值相差0.25%，说明该优化工艺参数可用于指导阿克苏骏枣多糖的提取。

2.3 抗氧化活性测定结果

利用响应面试验优化得到的工艺参数，提取骏枣粗多糖，并按1.3.5节的方法对其进行醇沉、脱色、脱蛋白，再对得到的纯化多糖进行抗氧化活性测定。

2.3.1 铁还原抗氧化能力

Fig.7 FRAP value of jujube polysaccharides in comparison with vitamin C图7 骏枣多糖和VC的FRAP值

铁还原抗氧化能力（FRAP值）的测定结果见图7。FRAP法是测定物质总抗氧化能力的一种方法，其值越大，表明待测物质的总抗氧化能力越强。由图7可知，FRAP值与样品的质量浓度呈正相关，质量浓度越高，FRAP值越大，样品的抗氧化能力越强；与同质量浓度的VC标准品相比，骏枣多糖的总抗氧化能力明显较弱，这可能是由于多糖在脱色和真空干燥时的操作温度过高、时间较长有关。当骏枣多糖的质量浓度为2.0 mg/mL时，其FRAP值为0.850；Li Jinwei等[21]的研究结果表明，超声波提取的同等质量浓度的骏枣多糖FRAP值接近0.7，而热水提取的多糖FRAP值仅为0.5左右。说明超声波预处理辅助热水浸提法，比单纯使用超声波或热水浸提得到的骏枣多糖的铁还原抗氧化能力强。

2.3.2 ABTS＋•清除能力

BTS＋・的清除率Fig.8 ABTS＋・ scavenging rate of jujube polysaccharides in comparison with vitamin C图8 骏枣多糖和VC对ABTS

由图8可知，对ABTS+・的清除率随样品质量浓度升高而增大，最高可达54.29%；与同质量浓度的VC标准品相比，骏枣多糖对ABTS+・的清除能力相对较弱。当质量浓度为3.0 mg/mL时，骏枣多糖对ABTS+・的清除率为40%左右，明显高于渠琛玲等[22]关于新疆若羌红枣多糖的研究结果，这可能与多糖提取工艺及红枣品种有关。

图9 骏枣多糖和VC对DPPH自由基的清除率Fig.9 DPPH racial scavenging rate of jujube polysaccharides in comparison with vitamin C

2.3.3 DPPH自由基清除能力由图9可知，骏枣多糖对DPPH自由基的清除率随样品质量浓度升高而增大；与同质量浓度的VC标准品相比，骏枣多糖对DPPH自由基的清除能力相对较弱。当质量浓度为5.0 mg/mL时，骏枣多糖对DPPH自由基的清除率为51.43%，低于Li Jinwei等[21]的65%，更明显低于渠琛玲等[22]热水浸提法得到的3.0 mg/mL若羌红枣多糖对

DPPH自由基的清除率。

3 结论

在单因素试验的基础上，将响应面分析法应用于阿克苏骏枣多糖提取研究。实验结果表明，提取温度、液固比和提取时间的二次项对骏枣多糖得率的影响均达到显著水平，3 个因素对骏枣多糖得率的影响不是简单的线性关系。在各影响因素中，液固比对多糖得率的影响最大，其次是提取温度和提取时间。

应用响应面分析法优化新疆阿克苏骏枣多糖提取工艺条件，得到最佳提取工艺参数为：提取温度83 ℃、液固比17∶1（mL/g）、提取时间4 h。骏枣粗多糖的实际平均得率为9.51%，经回归分析和验证实验，此工艺参数合理可行。后续分离纯化得到的骏枣多糖具有一定的清除ABTS+・和DPPH自由基能力，总抗氧化能力相对前人的研究结果较强，可能和纯化工艺有关，还需探索和优化。

与传统热水提取法相比，超声波预处理结合热水提取法提取红枣多糖能显著缩短提取时间，提高多糖提取得率，保持多糖的高抗氧化活性；但影响红枣多糖提取得率的因素很多，有待深入研究。综合考虑生产成本，可以尝试利用超声波预处理结合热水提取法指导阿克苏骏枣粗多糖的生产。

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Optimization of Extraction Process and Antioxidant Capacity of Polysaccharides from Zizyphus jujuba cv. Junzao

LI Yunlong1,2, YU Zhenyu3, GAO Haiyan1,2,*, YANG Hailong4, ZHENG Quan5, LI Xia5
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Key Laboratory of Fruits and Vegetables Postharvest and Processing Technology Research of Zh ejiang Province, Food Science Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China; 3. Aksu Vocational and Technical College, Aksu 843000, China; 4. College of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China; 5. Forestry Bureau of Zhuji City, Zhuji 311800, China; 6. Specialized Farmers Cooperatives of Aksu Maoyuan Fruit, Aksu 843000, China)

Polysaccharides with antioxidant activity were extracted from Zizyphus jujuba cv. Junzao fruits with hot water after ultrasonic pretreatment (120 W ultrasonic power, 60 ℃ for 30 min). Important extraction conditions were optimized by employing response surface methodology based on Box-Behnken design. An extraction temperature of 83 ℃ and 4 h extraction with a liquid-to-solid ratio of 17:1 (mL/g) were found to be optimal. The extraction yield of crude polysaccharides under the optimized conditions was 9.51%. The crude polysaccharides from Zizyphus jujuba cv. Junzao had free radical scavenging capacity, and at a concentration of 5.0 mg/mL, the ABTS+・ and DPPH racial scavenging rates were 54.29% and 51.43%, respectively.

response surface methodology; polysaccharides; ultrasonic; antioxidant capacities

TS255.36

1002-6630（2015）04-0045-05

10.7506/spkx1002-6630-201504009

2014-08-24

浙江省科技援疆项目（2011C16045）

黎云龙（1988—），男，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏。E-mail：kaishi1206@163.com

*通信作者：郜海燕（1958—），女，研究员，博士，研究方向为食品物流保鲜与质量控制。E-mail：spsghy@163.com