支气管肺泡灌洗液葡聚糖检测对早期诊断侵袭性肺真菌感染的价值

沈 勇，刘 宝，翁云龙，肖齐俊，黄 鑫

(1.安徽医科大学附属六安医院急救中心，安徽六安 237005;2.安徽省立医院ICU，安徽 合肥 230001)

由于人口老龄化、抗生素滥用、器官移植、肿瘤化疗药物的广泛使用、ICU危重病人存活时间延长等因素影响，近20年来侵袭性肺部真菌感染的发病率呈急剧上升态势。但现状是临床医生对患者感染侵袭性肺真菌感染(IPFI)的警惕性不高，致使漏诊、误诊、错失最佳治疗时机、住院久、花费大甚至病死率升高;另一现状是IPFI过诊过治现象普遍，其根本原因是临床上对IPFI至今还没有简便准确的诊断方法。临床上常根据传统实验室方法做出诊断及治疗的决策有明显的局限性，因为真菌通常会在上呼吸道定植，培养或者涂片阳性不能得出肺部真菌感染的结论。而血清G试验及半乳甘露糖(GM)试验的易受众多因素干扰，假阳性及假阴性的出现比例较高，且血清G试验阳性结果出现时间较迟。近几年来在诊断侵袭性肺真菌感染方面国外大量试验研究表明，肺泡灌洗液G试验比血浆G试验的敏感度和特异性更高，具更高的诊断价值，而目前国内关于肺泡灌洗液真菌相关抗原检测的临床研究较少。

1 材料与方法

1.1 研究对象 为2011年6月至2013年12月入住六安市人民医院急诊ICU及重症医学科的危重症患者，总计入选病例172例，临床确诊侵袭性肺部真菌感染32例(其中侵袭性念珠菌8例、曲霉菌16例、隐球菌5例、酵母菌3例)，肺部普通细菌感染32例及单纯脑外伤无肺部感染32例，另76例是临床有发生侵袭性肺真菌感染的高危因素，但入院前两天通过相关检查未能明确诊断为侵袭性肺真菌感染患者。临床确诊真菌感染的标准按照2007年颁布的肺真菌感染诊断及治疗专家共识执行［1］，具体标准如下:符合宿主发病危险因素≥1项、具有侵袭性肺真菌感染的临床特征并具有肺组织病理学和(或)如下任何一项微生物学证据:(1)无菌术下取得的肺组织、胸腔积液或血液标本培养有真菌生长，但血液标本曲霉或青霉(除外马尼菲青霉)培养阳性时，需结合临床排除标本污染的可能;(2)肺组织活检标本、胸腔积液或血液镜检直接检出隐球菌;(3)肺组织标本、支气管肺泡灌洗液(BALF)或痰液用组织化学或细胞化学方法染色发现肺孢子菌包囊、滋养体或囊内小体。研究对象入选的条件:(1)平均年龄＞18周岁;(2)家属或者患者本人签字同意行纤维支气管镜肺泡灌洗检查;(3)患者同意多次采血行葡聚糖检测(入选前签署知情同意书)。研究对象排除条件:(1)患者不能耐受纤支镜检查及灌洗;(2)预计短期内死亡病例;(3)患者家属不同意纤支镜检查及反复采血送检者;(4)1周内进食真菌类如香菇等菌菇、灵芝和冬虫夏草等保健品者，以及接受香菇多糖和磺胺类药物治疗者。

1.2 技术路线 具体分组:肺真菌感染高风险患者即刻及第2天行相关检查，一旦确诊即入确诊IPFI组，经两次检查后未能明确诊断者则自动剔除。如患者无真菌感染危险因素，且临床表现及肺部影像学、微生物学检查无真菌感染证据，同时细菌感染存在者入普通细菌感染组。选择单纯颅脑损伤患者且无肺部感染证据者为无肺部感染组。76例有基础疾病危险因素或有肺部感染证据但早期(入院后前2 d)未能明确诊断为真菌感染者每日(连续5 d)行相关培养、镜检、实时PCR及影像学检查直至明确是否真菌感染，76例均符合宿主发病危险因素≥1项，且具侵袭性肺真菌感染的临床特征并具有肺典型影像学和(或)任一项微生物学证据即为确诊或者临床诊断成立定义为诊断组，经过5 d检查仍不能明确病原体者自动剔除;住院期间一直未行抗真菌治疗，但经过普通抗细菌治疗临床预后改善者定义为排除组。

全部研究对象入组后首先进行胸部CT检查，明确肺部感染病灶的具体位置后，以此确定纤支镜检查的目标段或亚段支气管。各组患者每日行肺泡灌洗液及抽静脉血留取血浆行葡聚糖检测，同时留取患者血常规、C反应蛋白等相关试验室检查指标。研究对象一旦确诊IPFI即给予根据培养结果选择的针对性抗真菌药物治疗。

1.3 肺泡灌洗液及血浆标本采集后进行葡聚糖检测试验 检测原理:应用双抗体夹心法原理。鲎试验检测法检测(1，3)-β-D葡聚糖水平。

1.4 统计学处理 应用 SPASS16.0软件进行处理，所得计量资料数据采用均数±标准差(±s)表示，三组间采用单因素方差分析，两组间采用独立样本t检验的方法，比较各组是否有统计学差异，取P＜0.05有统计学意义。绘制ROC曲线，确定肺泡灌洗液及血浆两种标本G实验诊断肺侵袭性真菌病的最佳临界值。

2 结果

2.1 研究对象一般资料 入选研究对象患者共172例，其中确诊肺部真菌感染组、普通细菌感染组及无肺部感染组各32例。另有符合以下条件:(1)患真菌感染的高风险因素之一包括实体器官移植、血液系统恶性肿瘤、长期化疗及接受糖皮质激素治疗等;(2)诊断为肺部感染，但入院前2 d未明确病原体，称未明确组患者共76例。收集研究对象的一般生理学数据见表1。

2.2 IPFI组、普通感染组、无感染组患者 BALF及血浆BG水平比较 三组患者肺泡灌洗液及血浆葡聚糖浓度见表2及图1，IPFI组BALF BG浓度最高，均值为(589.94 ±317.17)ng·L－1，其次为普通感染组为(112.28 ±61.86)ng·L－1，各组之间数值比较均有统计学差异;IPFI组血浆BG浓度最高，均值为(346.13 ±214.06)ng·L－1，其次为普通感染组为(70.88 ± 47.18)ng·L－1，各组之间数值比较均有统计学差异。

表1 研究对象一般生理学数据

表2 三组患者肺泡灌洗液及血浆葡聚糖浓度比较

2.3 76例入院时未确诊组患者最后诊断情况及参数比较 76例入院时未确诊IPFI病例在随后的5 d检查中有29例明确诊断及临床诊断为侵袭性肺真菌感染(其中BALF直接镜检见隐球菌2例，两次及以上镜检见可疑曲霉菌和酵母菌菌丝分别2例和1例，两次培养同一念珠菌、新隐球菌、曲霉菌分别8例、5例、11例)，29例因为不能明确病原体而剔除，余下18例排除真菌感染。诊断组患者BALF葡聚糖浓度升高均早于血浆浓度升高，其中13例早24 h，而有7例早48 h。诊断组BALF BG浓度明显高于排除组(表3)，BALF BG浓度为149.5 ng·L－1时的约登指数值最大，为0.87，预测IPFI的敏感性为96.6%，特异性为 90.48%(AUC=0.982，P ＜0.001)(图2)。诊断组血浆BG测得水平也显著高于排除组(表3)，血浆BG浓度为81 ng·L－1时约登指数最大，为0.81，预测 IPFI的敏感性为96.6%，特异性为85.7%(AUC=0.982，P ＜0.001)(图3)。

3 讨论

并发侵袭性肺真菌感染是致实体器官移植及血液系统恶性肿瘤患者死亡的主要原因［2］。最近的数据显示重症医学科患者发生真菌性肺部感染的比例呈增高趋势［3］，早期的尸体活检显示重症病房医生往往对肺真菌感染的几率认识不足［4］，越来越多的研究显示慢性阻塞性肺病、肝硬化、接受糖皮质激素治疗患者等均为发生侵袭性肺部真菌感染的高危因素，此外长期标准化疗程联合应用多种抗结核药的老年患者呼吸道真菌二重感染的几率甚至达到35.1%。为了提高临床医生对此疾病的认识，国内外近几年均出版了侵袭性肺部真菌感染诊疗相关指南，这又导致临床上过度诊断、过度治疗的问题。故此类患者保障治疗成功和降低治疗费用及药物副作用的关键是早期正确诊断出侵袭性肺真菌感染。肺部高分辨率CT上显示的“晕征”不足以诊断曲霉菌感染［5］，组织活检是诊断的金标准，但一者创伤大且不能被患者家属及临床医生接受，二者因为准确取材部位的问题导致活检阳性率很低。传统的呼吸道痰培养出真菌方法的敏感性及特异性均仅50%左右，故有近一半的侵袭性肺真菌感染患者会被误诊、漏诊［6］。

表3 76例入院时未确诊组患者最后诊断情况及参数比较

葡聚糖是细胞壁的重要成分，约占其干燥重量的80% ～90%。而这其中(1，3)-β-D葡聚糖(BG)占真菌细胞壁成分50%以上，是真菌细胞壁上的大量存在而又特有的抗原成分，其存在形式以(1，3)-β-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链，分支状(1，6)-β-D葡萄糖残基作为侧链。当真菌经各种途径进入人体的血液或深部的组织后，经组织吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，真菌胞壁中可释放出来游离的BG，从而使血液、组织间液及特定体液中BG含量增高。当真菌侵入并存在体内含量较少时，机体的免疫系统可将其清除，不造成感染。真菌感染表浅的组织后，表浅组织部位吞噬细胞极少，不会有大量吞噬细胞吞噬处理后释放出BG，故BG在体液中的量不增高，因而血清G试验是IPFI的一个重要的诊断依据。血清G试验作为一种快速、无创的检测方法，其在诊断IPFI中的价值已得到肯定［7］。但研究发现多种因素能影响血清G试验结果［8］，并且在肺部真菌感染早期BG尚未释放入血，故在血清中峰浓度出现较迟，从而影响早期诊断出IPFI［9］。近年来学者们对动物实验的研究发现，肺部被真菌感染动物的肺泡灌洗液中(1，3)-β-D葡聚糖会显著升高，同时实验动物感染后l、3、5 d血浆G实验敏感性分别为58.33%，75%，75%，实验组感染后1、3、5 d，而肺泡灌洗液的敏感性第1天就达到了75%，第3天进一步升高至83.3%［10］，这项动物试验提示侵袭性肺真菌感染患者肺泡灌洗液(1，3)-β-D葡聚糖浓度的变化可能比血浆更早、更敏感。国内外对此曾有相关研究报道，但实施批量患者临床试验较少。我们的研究结果显示IPFI组 BALF(1，3)-β-D 葡聚糖平均浓度为(589.94 ± 317.17)ng·L－1，显著高于单纯肺炎组(112.28 ± 61.86)ng·L－1和非感染组(28.78 ±11.53)ng·L－1，差异均有统计学意义;IPFI组血浆(1，3)-β-D 葡聚糖平均浓度为(346.13 ±214.06)ng·L－1，显著高于单纯非真菌感染肺炎组(70.88±47.18)ng·L－1和非感染组(13.56 ± 5.19)ng·L－1，差异均有明显统计学意义，但单纯肺炎非真菌感染组和无肺部感染组比较，差异并无明显统计学意义。因此我们可以得出结论，BALF G试验同血浆G试验一样，在诊断IPFI方面具有较高的诊断价值。在比较各组患者的血浆与BALF BG浓度发现，三组患者BALF中BG浓度均显著高于血浆。初步分析可能的原因包括:(1)行葡聚糖检测的时间为确诊当日，此时(1，3)-β-D葡聚糖可能还没有大量释放入血，近而导致肺泡灌洗液浓度高于血浆，另外(1，3)-β-D葡聚糖是真菌的细胞壁被破坏释放产物，并不需要完整的菌体，当感染局限于少数脏器，如肺部，没有形成真菌血症，只有少量的BG释放入血，这就导致血浆G试验结果阴性或偏低，而针对病变部位的肺泡灌洗液这种真菌细胞壁破坏后释放产物较多。(2)真菌只有经吞噬细胞的吞噬并消化等处理后，BG从胞壁中释放出来才能被检测到。恰恰是肺泡及肺泡液中天然存在着大量吞噬细胞，吞噬并消化真菌后将大量BG成分逐步释放进支气管肺泡液中，使BALF标本G实验的敏感性保持在较高水平。我们的研究还发现一个有趣的现象，普通感染组血浆与肺泡灌洗液葡聚糖浓度虽然小于确诊组，但仍高于无感染组，这其中的可能原因为入住重症病房的肺部感染患者均为重症病例，此时大剂量广谱抗生素导致真菌局部定植可能，从而导致浓度升高，另一个可能的原因是重症患者使用的药物比较复杂，从而干扰了检测结果。

通过对入院时有高风险因素而未确诊肺部真菌感染的76例患者研究发现，在随后的5 d检查中有29例患者被确诊或者临床诊断为侵袭性肺真菌感染(确诊7例，临床诊断22例)。确诊及临床诊断患者肺泡灌洗液葡聚糖浓度升高均早于血浆葡聚糖浓度升高，其中13例早24 h，有7例早48 h。诊断组的BALF BG浓度显著高于排除组，BALF BG浓度为 149.5 ng·L－1时的约登指数最大，为 0.87，预测IPFI的敏感性为96.6%，特异性为90.48%(AUC=0.982，P ＜0.001)。诊断组血浆 BG 浓度显著高于排除组，血浆BG浓度为81 ng·L－1时的约登指数值最大，为 0.81，预测 IPFI的敏感性为96.6%，特异性为 85.7%(AUC=0.982，P ＜0.001)。这再次表明肺泡灌洗液葡聚糖浓度峰值出现时间要早于血浆，利用肺泡灌洗液葡聚糖浓度变化能更早的指导对高危患者进行干预治疗。另外比较两者的特异性及敏感性发现，两者在诊断侵袭性肺真菌感染的敏感性方面无明显差异，而肺泡灌洗液的特异性要高于血浆，这可能与药物等干扰因素在肺脏肺泡液中浓度偏小有关。

综上所述，BALF的G试验与血清G试验相比，具有较高的特异性，同时肺泡灌洗液中葡聚糖峰值出现要早于血浆，有利于早期诊断，而且检测影响因素相比较少。但本研究的不足之处也比较明显，一是本研究为单中心，小样本研究，二是患者在进行支气管肺泡灌洗时，不同的灌洗量以及不同的灌洗液回收率也会对结果产生影响，三是因天然细胞壁缺乏BG的接合菌属，及有荚膜包裹难以释放BG入血的隐球菌，使G试验假阴性，进而不能诊断，四是BG抗原的广谱特异性，不能进一步区分酵母菌及曲霉菌。

［1］Segal BH，Walsh TJ.Current approaches to diagnosis and treatment of invasive aspergillosis［J］.Am J Respir Crit Care Med，2006，173:707－717.

［2］李 艳，于 力.造血干细胞移植后侵袭性真菌感染的现状与未来［J］.中国试验血液学杂志，2011，19(2):517 －522.

［3］张晓明，田永刚，李海波.ICU病原菌分布及耐药性分析［J］.中华医院感染学杂志，2012，22(7):1500－1502.

［4］曾秀忠，袁春梅，麦群娣，等.65例肺结核并发二重真菌感染的相关危险因素分析［J］.中国当代医药，2012，19(19):40 －41.

［5］Kousha M，Tadi R，Soubani AO.Pulmonary aspergillosis:a clinical review［J］.Eur Respir Rev，2011，20(121):156 － 174.

［6］王瑞娟，王 萍，张学伟，等.电子支气管镜肺活检对周围型及弥漫性肺病变的诊断价值［J］.临床肺科杂志，2011，16(3):334 －335.

［7］León C，Ruiz-Santana S，Saavedra P，et al.Value of β-D-glucan and Candida albicans germ tube antibody for discriminating between Candida colonization and invasive candidiasis in patients with severe abdominal conditions［J］.Intensive Care Med，2012，38(8):1315 －1325.

［8］Metan G，Agkus C，Nedret Koc A，et al.Does ampicillin-sulbactam cause false positivity of(1，3)-beta-D-glucan assay?A prospective evaluation of 15 patients without invasive fungal infections［J］.Mycoses，2012，55(4):366 －371.

［9］黄晓军.肺部侵袭性曲霉菌感染的诊断思路［J］.中国真菌学杂志，2011，6(3):129 －131.

［10］刘书娟，于化鹏.半乳甘露聚糖与1，3－β－D葡聚糖在侵袭性烟曲霉菌感染诊断的实验及临床研究［J］.中国危重病急救医学，2012，24(2):90－95.