自噬对多发性骨髓瘤细胞增殖的影响

高灵素，虞国慧

(安徽省六安市人民医院，安徽六安 215004)

多发性骨髓瘤(MM)是造血系统恶性肿瘤，异常的浆细胞能分泌大量异常的单克隆免疫球蛋白［1］，正常途径难以降解异常克隆的免疫球蛋白，异常M蛋白会聚集在细胞的内质网内。能诱导细胞内产生未折叠蛋白反应(UPR)，即大量未折叠或错误折叠的蛋白在内质网产生，进而会导致细胞死亡。诱导细胞自噬(autophagy)则是MM细胞保护其免受未折叠蛋白影响的重要途经之一［2-3］，本研究观察体外经自噬诱导及阻断剂作用后MM细胞增殖能力的变化，并检测自噬相关调节基因的变化，从不同角度探讨MM的发病机制。

1 材料和方法

1.1 细胞株来源及细胞分组 本实验使用细胞株均由苏州大学邱玉华教授惠赠;实验过程中，U266细胞随机分为正常培养细胞组、雷帕霉素处理组、3-MA处理组，对照组如下:无血清培养条件下的U266细胞组、无血清培养条件下雷帕霉素处理U266细胞组、无血清培养条件下3-MA处理U266细胞，正常培养和无血清条件下培养的Jurkat细胞。雷帕霉素和3-MA药物浓度均为1 000 μg·L-1。

1.2 CCK8法检测细胞活力 调整细胞密度为2×108·L-1，接种于 96 孔培养板，立即加入 10 μL CCK-8试剂，后分别间隔24 h加入CCK-8试剂，直至培养4 d，加入试剂后均继续在培养箱内培养3 h，取出后在450 nm波长处测定各实验分组的吸光度，根据吸光度绘制增殖曲线。

1.3 细胞凋亡水平及自噬泡测定 U266细胞以2×108·L-1密度接种于培养瓶，按实验分组分别加入雷帕霉素及3-MA处理，于正常培养的24及72 h收集细胞，采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。培养96 h后离心洗涤去除处理因素，继续培养48 h，检测各实验组细胞内凋亡水平。同时检测对照组U266细胞内凋亡率。Atg8为自噬小体形成的第2个泛素样蛋白结合系统，可以特异性的与MDC结合，因此，我们通过荧光染色进行标记，在荧光显微镜下可见浆细胞核周区域点状结构荧光。培养24及72 h时均取少量U266细胞进行MDC染色，孵育15 min后置于荧光显微镜下观察染色情况。

1.4 免疫印迹分析细胞内LC3蛋白水平 按实验分组分别收集培养24及72 h的U266细胞，按操作说明提取细胞内总蛋白，统一调整所提取的各组蛋白浓度至4 g·L-1。每孔加入60 μg蛋白进行蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)。设置电泳的电压为恒压70 mV，放入电泳槽内，直至蛋白电泳至分离胶底部;取出凝胶，按顺序放置好纤维素膜，在90 mV条件下在转移槽内转移40 min。取下纤维素膜，脱色摇床上用含5%的脱脂奶粉的TBST封闭1 h。TBST清洗3次，将一抗至1∶1000的浓度(LC3∶兔抗人IgG)，在4℃条件下孵育过夜，然后再次用TBST清洗3次，稀释辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1000)与纤维素膜作用1 h，反应后TBST清洗共3次。使用化学发光法显影于X胶片上。样本的免疫印迹条带均与同一样本的内参比较后作统计学分析。

1.5 自噬相关基因 mtor、Beclin1、Atg5分析 分别收集培养24及72 h的各实验组细胞，采用RNeasy kit(Qiagen)试剂盒提取U266细胞RNA样本，设置反应条件，每次取试验各组细胞1 μg RNA进行逆转录，按同等剂量cDNA进行PCR反应。取PCR产物4 μL，加入指示剂 5 × Loading Buffer 2 μL，120 V，100 mA下进行凝胶电泳30 min。结束后进行凝胶成像仪成像并保存结果。引物序列由上海生物工程公司设计并合成，以β-actin为内参(表1)。操作按说明进行，PCR共32个循环。

1.6 统计方法 数据以均数±标准差表示，应用SPSS 17.0软件进行分析。细胞增殖及细胞凋亡率采用t检验，以α=0.05为检验水准。

表1 引物序列及片段大小

2 结果

2.1 自噬水平变化对MM细胞增殖的作用 根据绘制的增殖曲线我们发现，无血清培养条件下Jurkat细胞增殖基本停止，显著低于正常对照及无血清培养U266细胞。我们的实验结果表明，3-MA或雷帕霉素处理组细胞的增殖水平与对照组相比，在培养24及72 h有显著区别(P＜0.05)，故确定实验时间点为24及72 h。而正常条件下培养24 h，雷帕霉素及3-MA处理的细胞增殖水平有呈上升趋势，较未处理组缓慢。但随着培养时间延长至72 h，处理组细胞增殖处于缓慢上升趋势(图1)。

2.2 药物处理对自噬水平的影响 自噬泡可以通过荧光染色后在电镜下观察到，如图所见，正常培养U266细胞核周围环绕蓝色点状荧光，加入雷帕霉素处理24 h后细胞核周荧光增多，表明与正常培养组相比自噬水平有增多。自噬抑制剂3-MA作用24 h后U266细胞核周荧光减少，提示自噬泡减少，自噬水平减低。而继续延长培养时间后观察发现，培养72 h雷帕霉素处理细胞内自噬水平明显增高。而延长培养时间至72 h 3-MA处理组细胞内核周蓝色点状荧光同样增多(图2)。

2.3 U266细胞凋亡水平检测 加入雷帕霉素或3-MA的U266细胞培养24 h后检测凋亡水平。我们发现各组细胞凋亡水平均升高，分别为1.7% ±0.2%(对照组);16.8% ±0.61%(3-MA 处理组);19.1% ±1.0%(雷帕霉素处理组);且 P ＜0.01，延长培养时间至72 h，雷帕霉素处理组U266细胞凋亡水与培养24 h无明显变化16.9% ±0.46%，而3-MA处理组凋亡水平明显下降9.0% ±0.70%(图3)。

2.4 正常培养U266细胞内LC3蛋白表达 LC3蛋白为自噬相关蛋白，在自噬泡形成过程中始终可检测到，当哺乳动物发生自噬时，随着自噬泡的形成，细胞内LC3的含量明显增加。本实验经蛋白质印迹法检测发现U266细胞内存在低水平表达的LC3蛋白，并发现其高于正常培养的Jurkat细胞(图4)。

2.5 药物处理后正常培养下U266细胞自噬相关基因表达的影响 正常培养条件下U266细胞培养瓶内加入雷帕霉素培养24 h，通过RT-PCR检测发现mtor基因表达水平上升，而加入3-MA培养24 h后mtor基因表达水平也同样呈上升表现。而培养至72 h正常培养组、雷帕霉素处理组及3-MA处理组mtor基因表达水平继续上升(图5)。同时检测Atg5及Beclin1基因水平发现，Atg5基因表达趋势与mtor基因一致(图6)。而3-MA处理细胞组内Beclin1基因表达水平均较其余2组低(图7)。内参如下(图8)，各组数据均与同一内参进行比较。

3 讨论

多发性骨髓瘤细胞是一种恶性浆细胞病，其肿瘤细胞起源于骨髓中的浆细胞，其特征为骨髓浆细胞异常增生伴有单克隆免疫球蛋白或轻链(M蛋白)过度生成，极少数患者可以是不产生M蛋白的未分泌型MM。在一般情况下细胞内存在的异常蛋白能导致细胞死亡，细胞能通过多种途径降解蛋白，研究发现自噬具有降解异常蛋白的能力。自噬可以降解胞内堆积的毒性蛋白质，故而我们推断自噬是维持多发性骨髓瘤细胞发生、发展的重要因素。已有研究证实抗肿瘤药物通过自噬途径起作用［4］。但同时研究发现，自噬对细胞的生存和增殖起到不利的作用，过度的自噬能导致细胞死亡［5］。

研究资料发现，Hoang等研究了MM细胞株中的自噬情况，结果表明其中存在一定水平的自噬现象［6］，当细胞暴露于蛋白酶体抑制剂硼替佐米、受到内质网应激，或用mTOR抑制剂处理时，细胞内的自噬水平会上升，帮助在上述环境下维持细胞长期生存。同样的，研究证明饥饿条件同样可抑制mTOR蛋白的活化，进而诱导细胞自噬发生，通过对自身细胞内各种营养元素物质的降解来维持细胞增殖［7］。雷帕霉素为现有的mTOR蛋白抑制剂，研究发现，培养液内加入雷帕霉素可诱导自噬的发生［8-9］。同时研究发现，自噬过程中有Ⅰ/Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系统参与。3-MA可通过抑制Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(classⅢPI3K)来抑制自噬的发生，所以该药物广泛作为自噬抑制剂使用。然而又有研究发现，如果在正常培养条件下延长3-MA和骨髓瘤细胞的作用时间，其自噬水平反而呈明显上调状态［10］。这可能是由于3-MA同时对I型PI3K系统也有抑制作用，起到诱导自噬的作用。故3-MA对自噬起到抑制及诱导的双重作用。

多发性骨髓瘤细胞内存在基础自噬，为了研究其对细胞增殖的作用，我们绘制了饥饿培养条件下U266细胞及Jurkat细胞的增殖曲线。结果发现在体外饥饿条件下U266细胞仍具有增殖能力直至培养72 h。而对照组Jurkat细胞的增殖成低平曲线，基本停止增殖;在血清培养液条件下加入雷帕霉素及3-MA，细胞增殖水平较未加入试剂的U266细胞增殖水平明显低下。

本实验研究了 mtor、Atg5及 Beclin1基因在U266细胞内的表达。雷帕霉素可上调细胞内自噬，而3-MA在处理24 h时对自噬起到抑制的作用，到培养72 h，检测自噬相关基因表达我们发现示3-MA反而对自噬起到诱导作用。这就证明了培养时间延长到一定程度，3-MA对I型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系统的抑制起主导作用，诱导自噬发生。Beclin1蛋白是Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶系统的组成部分，故Beclin1基因与Atg5基因相比，3-MA处理组培养24及72 h后Beclin1基因表达水平均较正常培养及雷帕霉素处理组低。故而我们可以得出结论，提示在培养过程中3-MA对Ⅲ型PI3K系统的抑制作用一直存在，故而导致Beclin1基因表达水平下降。

虽然我们的实验发现正常培养条件下雷帕霉素及3-MA对细胞内自噬的影响不同，但多发性骨髓瘤细胞的增殖曲线为相同趋势。故可推测过度诱导自噬及抑制自噬均可能造成细胞死亡，抑制细胞增殖。接下来本实验研究细胞内凋亡水平。

自噬与凋亡均属于程序性细胞死亡范畴，但越来越多的研究发现二者在某些情况下存在着联系［11-12］，有着相互协同发展或拮抗的作用。本实验发现雷帕霉素及3-MA处理24 h后骨髓瘤细胞内内凋亡水平均升高。但是到培养72 h时，3-MA处理的细胞组内凋亡水平较培养24 h时下降。表明培养时间延长，培养液内营养物质逐渐降解，接近饥饿环境，3-MA通过对抗细胞凋亡来延长细胞生存。

综上所述，自噬可促进MM细胞增殖，并维持其长期生存，但自噬抑制剂、阻断剂如雷帕霉素及3-MA也可同时抑制MM细胞增殖，促进细胞凋亡。证实自噬对MM细胞生存具双重作用，或双向调节左右，有必要进一步深入探讨，可能对多发性骨髓瘤的治疗提供新的治疗靶点。

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