CDK8、KAI1蛋白在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中表达对患者预后的影响

熊 娟

(湖北省黄石市中医医院妇科，湖北黄石 435000)

宫颈癌是三大妇科恶性肿瘤之一，死亡率排名第二，仅次于乳腺癌［1］。宫颈癌特点具有侵袭能力强、恶性程度高、早期可由淋巴结转移、预后差的特点。宫颈癌的发生与发展，经历宫颈不典型增生、原位癌、微小浸润癌、浸润癌等动态演进过程。宫颈癌的发生与发展与基因异常表达、癌基因激活、DNA损伤修复、DNA转录表达失控、抑癌基因失活等相关，最根本的表现为细胞周期调控机制紊乱［2］。细胞周期调控蛋白失调可作为导致肿瘤的原因之一［3］。恶性肿瘤拥有侵袭和转移的最重要的生物学特征，侵袭和转移中药的环节之一就是黏附力降低或者丧失，侵袭、转移与预后密切相关，组织分型、临床分期、分化程度、淋巴转移等因素可反应宫颈癌恶性程度及预后［4］。本文采用免疫组织化学法检测CDK8与KAI1的表达情况，分析两组因子与宫颈癌患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2010年2月—2014年4月黄石市中医医院保存的石蜡组织标本，宫颈癌组织36例，其中宫颈腺癌17例，鳞癌19例。根据2000年FIGO临床分期标准，Ⅰ期15例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例;按病理分化程度，Ⅰ级17例，Ⅱ级11例，Ⅲ级8例;发生淋巴结转移15例，未发生淋巴结转移21例;宫颈上皮内瘤变组织(CIN)110例，其中宫颈低度病变组(CINⅠ50例)，宫颈高度病变组(CINⅡ30例、CINⅢ30例);正常宫颈组织20例。患者年龄29～68岁，中位年龄50岁，患者均未经过放化疗等特殊方式治疗。标本处理:经10%的中性福尔马林固定，石蜡包埋标本，以5 μm厚度切片代用。对36例宫颈癌患者进行1～4年的随访，统计不同分组的死亡率。

1.2 仪器与试剂 免疫组化检测试剂盒、DAB显色液均由福州迈新生物技术有限公司提供，CDK8、KAI1绵羊抗人多克隆抗体由 R＆D公司提供，CDK8、KAI1鼠抗人单克隆抗体工作液由福建迈新生物技术有限公司提供，已知的CDK8、KAI1阳性对照染色片。

1.3 实验方法 (1)CDK8蛋白的检测:采用免疫组织化学染色法，采用二甲苯脱蜡及梯度酒精水化处理切片后，加入少量3%H2O2抑制内源性过氧化酶活性，加入一定量的枸橼酸钠(浓度:0.01 mol·L－1，pH6.0，100℃)修复抗原 10 min 后，用 PBS 冲洗4遍，在10%BSA的环境中封闭非特异性位点10 min。再加入鼠抗人CDK8单克隆抗体于4℃孵育过夜，然后用PBS冲洗3遍，加入CDK8绵羊抗人多克隆抗体于20℃孵育1 h，用PBS冲洗5遍，最后进行DAB显色观察。(2)KAI1蛋白的检测:采用免疫组织化学染色法，操作方法同上，严格按照试剂盒说明书进行实验操作。

1.4 结果判定 CDK8、KAI1结果判定:于400倍光镜下观察，随机选取正常宫颈组织切片、CIN组织切片、宫颈癌切片上5个视野，运用奥林巴斯显微镜拍下视野图像，使用IPP6.0软件处理，将图像灰度值转换成吸光度值，计算出平均吸光度值(OD)=累积吸光度/面积。阳性对照采用已知的阳性对照染色片，阴性对照采用PBS代替鼠抗人CDK8、KAI1单克隆抗体为对照。KAI1阳性表达为在细胞膜或细胞浆内出现棕黄色或黄色颗粒。

2 结果

2.1 CDK8在宫颈癌及 CIN组织中的表达CDK8在组织细胞内阳性表达，细胞核显示为棕黄色。正常宫颈组织中几乎没有阳性细胞(图1a);CINⅢ组织细胞中表达，阳性细胞较正常宫颈明显增加(图1b);宫颈腺、鳞癌组织阳性细胞棕黄色较深，细胞核增大异型(图1c);CDK8在各组间表达，宫颈低度病变组显著强于正常宫颈组(P＜0.05)，宫颈高度病变组显著强于宫颈低度病变组(P＜0.05)，宫颈癌组显著强于宫颈高度病变组(P＜0.05)，见表1。

2.2 CDK8表达与宫颈癌临床特征的关系及预后单因素分析结果显示，CDK8早宫颈癌组织表达与年龄、宫颈癌组织分型、临床分期、细胞分化程度相关因素无关(P＞0.05)，与淋巴结转移有关(P＜0.05)。见表2。对36例患者进行随访结果，临床分期Ⅰ期死亡2例，死亡率13.33%;Ⅱ期死亡3个，死亡率 20.08%;Ⅲ期死亡 3例，死亡率 37.50%。淋巴结转移组死亡7例，死亡率46.67%;淋巴结无转移组死亡4例，死亡率19.05%，淋巴结转移组死亡率显著高于淋巴结无转移组(P＜0.05)。

2.3 KAI1在宫颈上皮内瘤样病变中的表达及预后 正常宫颈组织KAI1可明显观察到棕黄色阳性细胞的存在，随着病情的发展，棕黄色阳性细胞逐渐减少。见图2A～E。KAI1蛋白在正常宫颈组织、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ组织、宫颈癌组织的阳性表达率分别为100%、68.00%、53.00%、40.00%、16.67%;KAI1 在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ组织的表达显著强于在宫颈癌组织(P＜0.05)，在正常宫颈组织、CINⅠ的表达显著强于在CINⅢ(P＜0.05)，在正常宫颈组织表达显著强于在CINⅡ(P ＜0.05)。见表3。

表1 CDK8在各组织表达的平均吸光度比较

表2 CDK与宫颈癌临床特征关系单因素分析结果

表3 KAI1在各组织中阳性表达率

2.4 KAI1表达与宫颈癌临床特征的关系及预后KAI1在宫颈癌组织中的表达均与年龄、组织分型、临床分期、分化程度、淋巴结转移无关(P＞0.05)。见表4。

3 讨论

宫颈癌的发生与发展与基因异常表达、癌基因激活DNA损伤修复、DNA转录表达失控、抑癌基因失活等相关，最根本的表现为细胞周期调控机制紊乱［5］。细胞周期调控蛋白失调可作为导致肿瘤的原因之一［6－7］。主要的细胞周期调控分组有3大类:细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)、细胞周期蛋白(cyckins)、CDK抑制物(CKI)，它们之间相互作用进行精细与复杂的细胞周期调控。CDK是关键调控因子，能启动DNA合成、促进细胞周期时相转变、调控细胞转录，CDK活血受到cyslins正调控和CKIs负调控影响。CDK的活性异常与肿瘤的发生、发展有密切关系［8］。

表4 KAI1表达与宫颈癌临床特征的单因素分析

CDK8属于CDK家族一员，分子量为53～55 Ka，位于基因的13q12、13 段，能与 MED12、MED13、cyclinC结合组成四聚体调控复合物，MED12、cyclinC负责调节CDK8活性，MED13负责聚集CDK8到四聚体调控复合体。人体CDK8还有一种Ser酶，其能调节与 cyclins、CKI结合［9］。现代研究对CKD8具体致癌机制尚未明了，有相关研究表明，CDK8能正向调节RNA聚合酶Ⅱ，间接抑制β-catenin的表达，增加P53转录中得协同激活作用，正向调节EGR转录因子促进细胞生长及血管生成等。目前研究表明CDK8异常表达对大肠癌、胃癌、恶性黑色素瘤的发生有重要的作用。有研究发现，βcatenin、EGR转录因子、P53的异常表达与宫颈癌的发生密切相关，CDK8能正向调节EGR转录因子、P53的表达，负向调节 β-catenin的表达。KAI1蛋白属于四次跨膜超家族成员，分子量为29 610 Ka，长2.4 Kb，由267个氨基酸编码组成，其结构是细胞膜糖蛋白，主要分布在哺乳动物组织细胞及白细胞表面［10］。KAI1蛋白拥有一个大的细胞外亲水结构区和4各高度保守的疏水结构区。KAI1主要参与细胞与细胞外基质、细胞与细胞的相互作用及细胞的增殖活动［11］。KAI1蛋白能抑制肿瘤细胞转移，对细胞活动、黏附能力、转移增生有影响，并通过胞内信号通路介导肿瘤细胞的活动。通过Qac GT Pase和Src激酶抑制肿瘤细胞增殖，激活T细胞与抗原提呈细胞，进而抑制肿瘤细胞转移［12－13］。KAI1可在前列腺癌表达，也可在多种肿瘤(如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、食管癌)组织或者转移病灶中表达，随着病情的恶化，KAI1的表达呈下降或消失趋势［14－15］。KAI1表达下降或者消失，可在不影响原发肿瘤生长的条件下，促进转移瘤形成。本文结果发现，CDK8与患者的生存率和预后有直接关系，KAI1蛋白尚未发现与宫颈癌预后相关。两者之间并未存在直接关联，两者均可在组织或病灶中表达。

DK8在正常组织、CIN低度病变组织、CIN高度病变组织、宫颈癌组织中的表达呈显著递增的趋势(P＜0.05)，CDK8在宫颈癌组织的表达与淋巴结转移呈正相关，36例宫颈癌患者随访后，临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期死亡率分别为 13.33%、20.08%、37.50%，淋巴结转移死亡率(46.67%)显著大于淋巴结无转移(19.05%)，且有显著性差异(P ＜0.05)，随着病情的加重，CDK8表达增强，死亡率增大，说明CDK8的表达与患者的生存率和预后有直接关系;KAI1蛋白在正常宫颈组织、CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ组织、宫颈癌组织的阳性表达率分别为 100%、68.00%、53.00%、40.00%、16.67%;KAI1在宫颈癌组织中的表达均与年龄、组织分型、临床分期、分化程度、淋巴结转移无关(P＞0.05);结果提示，KAI1蛋白表达可能与宫颈癌预后没有关系，不能成为宫颈癌预后的一个有效指标。综上所述，CDK8与患者的生存率和预后有直接关系，可作为宫颈癌预后的一项指标，而KAI1蛋白尚未发现与宫颈癌预后相关，需后续研究确认，为临床提供了理论依据。

［1］李 贞，孙小丽，吴坤河，等.CDK8在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中表达及意义的初步研究［J］.实用妇产科杂志，2013，29(11):848－852.

［2］Sato A，Ishiwata T，Matsuda Y，et al.Expression and role of nestin in human cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer［J］.International Journal of Oncology，2012，41(2):441 －448.

［3］蔡 旺，齐 茹.CD44V6、MUC1在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达及其相关性［J］.中国老年学杂志，2012，32(16):3407－3408.

［4］Wiebren A Tjalma，Alison Fier，Olaf Reich，et al.Differences in human papillomavirus type distribution in high-grade cervical intraepithelial neoplasia and invasive cervical cancer in Europe［J］.International Journal of Cancer，2013，132(4):854 －867.

［5］丁晓萍，侯庆香，姚蕾蕾，等.CCR2-V64I基因单核苷酸多态性与宫颈癌及宫颈上皮内瘤变的相关性研究［J］.临床肿瘤学杂志，2013，18(7):586 －589.

［6］Quek SC，Lim BK，Domingo E，et al.Human papillomavirus type distribution in invasive cervical cancer and high-grade cervical intraepithelial neoplasia across 5 countries in Asia［J］.International Journal of Gynecological Cancer，2013，23(1):148 －156.

［7］张金瑾.宫颈锥形切除对阴道镜下多点活检诊断宫颈上皮内瘤样病变及早期宫颈癌的再评价［J］.安徽医药，2014，18(5):895－897.

［8］Barken SS，Rebolj M，Andersen ES，et al.Frequency of cervical intraepithelial neoplasia treatment in a well-screened population［J］.International Journal of Cancer，2012，130(10):2438 －2444.

［9］李 贞，孙小丽，吴坤河，等.CDK8在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中得表达及意义的初步研究［J］.实用妇产科杂志，2013，11(29):848－852.

［10］周 蕾，武世伍，俞 岚，等.胃腺癌组织KAI1的表达及与血管，淋巴管生成的关系［J］.四川大学学报 (医学版)，2014，45(1):43－48.

［11］陶 玲，赵卫东，程 敏，等.两种途径新辅助化疗方案在IIB期宫颈癌患者中的近期临床疗效对比［J］.安徽医药，2013，17(4):639－641.

［12］Chunnian He，Cuiqing Xu，Mingtang Xu，et al.Genomic amplification of hTERC in paraffin-embedded tissues of cervical intraepithelial neoplasia and invasive cancer［J］.International Journal of Gynecological Pathology，2012，31(3):280 －285.

［13］胡飞红，薛向阳，肖碧如，等.microRNA-466在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的表达及其意义［J］.温州医学院学报，2013，43(7):435－439.

［14］万晓春，杨慧娟，周晓燕，等.高危型HPV亚型及亚型组合检测宫颈癌及高级别宫颈上皮内瘤变的比较研究［J］.中国癌症杂志，2014，6(5):342 －348.

［15］张玉阳，韩义香，赵红琴，等.肿瘤转移抑制基因KAI1在宫颈癌的表达及人乳头状瘤病毒感染的相关性研究［J］.中华医院感染学杂志，2013，12(23):2796 －2798.