正相高效液相色谱法测定多维片类保健食品中维生素A的含量

邢亚东，王玲玲，黄丽丹

(1.安徽中医药大学，安徽合肥 230031;2.安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051)

维生素A是一种脂溶性维生素，主要存在于动物肝脏、蛋类、奶油和鱼肝油中，它是构成视觉细胞中感受弱光的视紫红质组成成分，同时维持骨骼正常生长发育并促进生长与生殖。人体缺乏维生素A，会影响暗适应能力，致儿童发育不良、干眼病、夜盲症等;过量摄入维生素A则出现皮肤干燥、脱屑和脱发等症状［1］。维生素A为一具共轭多烯侧链的环己烯，存在多种立体异构，其中全反式构型生物活性最强。目前，测定维生素A含量主要使用的比色法、荧光分光光度法、反相高效液相色谱法等［2－7］，均为顺反合并测定。2010年版《中国药典》维生素A测定法中首次收入了正相高效液相色谱法［8］，可有效分离顺、反构型，准确测定反式维生素A的含量。目前，食品国标尚未进行相应修订，保健食品企业标准多直接套用食品国标，原料多为合成品，检测结果与其生物活性不对等。本文根据多维片类保健食品中维生素A原料多采用维生素A醋酸酯干粉(微囊)［9］的特点，针对性地建立了简单有效的提取方法，进而采用正相高效液相色谱法有效分离维生素A的顺、反式构型，准确测定其中反式维生素A的含量，方法简便、快捷、准确，可有效用于多维片类保健食品中维生素A的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(日本岛津 LC－20AD);高速离心机(上海安亭科学仪器厂GL－21C);超声波清洗器(Elma P180H);电子天平(梅特勒XP205)。

1.2 试药 正己烷(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司);异丙醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司);维生素A对照品(中检院，供含量测定用，批号:100368－201301。1 g含维生素A醋酸酯343 mg，其中含反式维生素A醋酸酯96.9%);实验用样品:新成长快乐牌复合维生素咀嚼片(批号:2013－11－07)、倍爱牌多种维生素矿物质片(成人型)(批号:20130801)、奥诺康多种维生素矿物质片(批号:131005)、珠峰牌多种维生素片(中老年型)(批号:20130703、20130728)、珠峰牌多种维生素片(女士型)(批号:20130816、201310701)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex Luna silica(2)(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流动相:正己烷—异丙醇(99.7∶0.3)，流速:1.0 mL·min－1，检测波长:325 nm，柱温:室温。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取维生素A对照品13.94 mg，置10 mL棕色量瓶中，加正己烷溶解并稀释至刻度，摇匀;精密量取1 mL置50 mL棕色量瓶中，加正己烷稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液(每mL含反式维生素A醋酸酯9.27 μg)。

2.2.2 供试品溶液制备 取供试品20片，研细，取约0.2 g，精密称定，置15 mL棕色离心管中，精密加水4 mL，40℃超声15 min，放冷，用正己烷振摇提取3次，每次5 mL，合并正己烷提取液，加无水硫酸钠脱水后，氮吹浓缩至适量，加正己烷制成每毫升含维生素A 2～4 μg的溶液(按标示量折算)，摇匀，即得。

2.3 方法适用性试验 精密吸取对照品溶液6 μL，重复进样6次，按上述色谱条件测定，反式维生素A平均峰面积为1 224 213，相对标准偏差(RSD)=0.093%，表明仪器精密度良好。

分别吸取对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。对照品、供试品色谱中，维生素A顺、反式异构体均能有效分离。对照品色谱中反式维生素A理论塔板数为13 493，供试品色谱中反式维生素A理论塔板数为13 469。液相色谱图见图1。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10、12、15、20 μL，注入液相色谱仪，按照“2.1”色谱条件测定。以反式维生素A峰面积积分值为纵坐标(Y)，以绝对进样量为横坐标(X)，进行线性回归，得回归方程:Y=8 808X－3 800，r=0.999 9。结果表明，反式维生素A在9.27 ～185.33 ng的范围内峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.5 重复性实验 取同一批号的供试品(珠峰牌多种维生素片，批号:20130816)6份，分别制成供试品溶液，依法测定反式维生素A的含量，平均含量为 111.12 μg·g－1，RSD=2.5%，结果表明方法重复性良好。

2.6 稳定性实验 取新制备的供试品溶液分别在0、2、6、9、13、15、16、24 h 进行测定，反式维生素 A平均峰面积为694 462，RSD=1.2%。结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 回收率实验 精密称取已知含量的供试品(珠峰牌多种维生素片，批号:20130816，含量:111.12 μg·g－1)约0.1 g，置15 mL 棕色离心管中，共9份，分成3组，每组分别加入 12.1 mg·L－1维生素 A 对照品正己烷溶液 0.8、1.0、1.2 mL，依法制成供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果反式维生素A平均回收率为97.8%，RSD=2.5%，见表1。

表1 维生素A加标回收率

2.8 样品测定 取各供试品，按供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按照“2.1”色谱条件测定反式维生素A的含量;同时，按文献［2］的反相色谱条件测定顺、反式维生素A的合并含量，结果见表2。

表2 维生素A测定结果表

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 维生素A醋酸酯为不饱和酯类、呈油状、易氧化、溶于脂肪或有机溶剂，不溶于水，难以均匀地添加于固体保健食品中。目前原料生产企业将其微囊化，提高它的水溶性和稳定性，且形态由油状变为粉状，易于均匀分散制成固体制剂［9］。其壁材主要成分是明胶［10］，藉此，本文选择采用加水40℃超声使微囊破壁，再用正己烷提取。

3.2 提取方法的考察 分别对加水量、超声温度、超声时间、正己烷萃取次数等参数进行了考察，结果显示:加水4 mL、40℃超声15 min、5 mL正己烷萃取3次时，提取效率最高。

3.3 正、反相液相色谱测定结果比较 将供试品溶液分别采用正、反相高效液相色谱法进行测定，结果:反相色谱法未将维生素A顺、反式分离，测定结果明显高于正相色谱法。个别供试品中顺式维生素A比例较高，正、反相色谱法测定结果差异较大，因此，有必要将维生素A顺、反构型分开测定，以便真实反映产品的活性和品质。

［1］徐 芳，罗海吉.维生素A对人类健康生活的重要性［J］.分子影像学杂志，2013，36(1):28 －30.

［2］中华人民共和国国家标准.GB 5413.9－2010婴幼儿食品和乳品中A、D、E的测定［S］.北京:中华人民共和国卫生部，2010:1－10.

［3］食品卫生检验方法理化部分(二).GB/T 5009.82－2003食品中维生素A和维生素E的测定［S］.北京:中国标准出版社，2012:67－74.

［4］唐 婧，郑胜彪.维生素分析的研究进展［J］.科技信息，2011，21(5):490－491.

［5］陈万勤，王 瑾，黄丽英，等.高效液相色谱法同时测定配方乳粉中7种脂溶性维生素［J］.分析科学学报，2013，29(1):109－112.

［6］董爱军，崔艳华，杨 鑫.高效液相色谱法同时测定秋葵干蔬中的脂溶性维生素 A、E、K3［J］.分析测试学报，2011，30(8):887－891.

［7］朱 晨，周鲁卫.维生素A含量测定方法比较［J］.食品工业，2012，33(7):157 －159.

［8］国家药典委员会.中国药典(二部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:附录51.

［9］颜琳琦，戚绿叶，张丽媛，等.HPLC测定保健食品中微胶囊型维生素 A［J］.中国现代应用药学，2014，31(7):860 －863.

［10］兰海霞，孙 芸，燕雪花.微囊的制备方法研究进展［J］.亚太传统医药，2011，7(1):139 －141.