反相高效液相梯度洗脱法测定人血浆中丙泊酚浓度

李 莉，李 培

(新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐 830011)

丙泊酚(propofol)是一速效短效静脉麻醉药，又名异丙酚、普鲁泊福。由于麻醉效果见效极快、且麻醉后舒适感较好，除应用于麻醉诱导和麻醉维持［1－2］外，还广泛用于无痛肠镜、无痛胃镜检查以及无痛人工流产术。测定异丙泊酚血药浓度，对指导临床合理用药具有重要的意义。丙泊酚血药浓度的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)［1，3－8］、气 － 质联用(GC/MS)［9－10］、液相色谱 － 串联质谱(LC－MS/MS)［2］。后两种方法的灵敏度较高、特异性强、所需样品量少，但仪器设备较昂贵，难以普及推广。在高效液相色谱法中，电化学和二极管阵列［6］检测法国内应用较少。目前文献报道的高效液相色谱法主要有高效液相－紫外检测法(HPLCUV)［4，7－8］、高 效 液 相 － 荧 光 检 测 法 (HPLCFlu)［1，3，5］。为适应临床药代动力学研究的需要，本实验室经过内标、预处理方法和流动相的选择，研究并建立了用反相高效液相梯度洗脱法测定人血浆中丙泊酚浓度的方法，这是文献中首次出现梯度洗脱法测定血浆中的丙泊酚浓度。经实验证明，本方法具有较高的精密度和准确度，适用于临床血药浓度监测。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC－6AD液相色谱仪(北京超越未来科技发展有限公司)，ER－128A电子分析天平(A＆DDeompany，TLD，JAPAN);超声波清洗仪(500 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司);IKA MS3基本型圆周震荡摇床(广州仪科实验室技术有限公司);TDL－5A菲恰尔离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司);HGC－12A干浴氮气吹干仪(天津市恒奥科技发展有限公司);pH计(梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司)。

1.2 药品与试剂 丙泊酚对照品(中国食品药品检定研究院提供，批号:100806－200801，ID:4H01－51DP，纯度99.8%);卡马西平片(上海中西三维药业有限公司);乙腈(色谱纯，SIGMA公司);甲醇(色谱纯，SIGMA公司);实验用水为屈臣氏蒸馏水;磷酸二氢钾(分析纯，天津市福晨化学试剂厂);氢氧化四甲基胺(TMAH，10%，分析纯，天津市光复精细化工研究所);异丙醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司);环己烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司);正丁醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司);三氟乙酸(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Hanbon Science＆.Technology C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:流动相为乙腈/甲醇混合液(乙腈—甲醇按80∶20(V/V)的比例配制，作为有机相)—水(水相加1%的三氟乙酸调pH值到4)进行二元梯度洗脱，0～7 min(50∶50，V/V)，7 ～9 min(50∶50 ～70∶30，V/V)，9 ～22 min(70∶30，V/V);流速:1.0 mL·min－1;检测波长:274 nm;进样量:20 μL;柱温:40℃。

2.2 溶液配制 (1)丙泊酚标准储备液的配制:用移液枪精密量取丙泊酚对照品25 μL于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得到500.00 mg·L－1丙泊酚标准储备液。密闭后，于4℃冰箱保存。(2)丙泊酚系列标准溶液的配制:用移液管精密量取500.00 mg·L－1的丙泊酚标准储备液 12.5 mL 于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到浓度为250.00 mg·L－1丙泊酚甲醇溶液。依次逐级稀释，最后得到 500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg·L－1的系列标准溶液。(3)内标液的配制:取卡马西平片剂20片，精密称定，研细。精密称取细粉25 mg置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 mL置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。(4)磷酸盐缓冲液的配制:称量磷酸二氢钾1.36 g溶于100 mL蒸馏水中，配制成 0.1 mol·L－1。(5)四甲基氢氧化铵固定液的配制:用移液管精密量取10%(W/W)四甲基氢氧化铵溶液4.7 mL于25 mL容量瓶中，用异丙醇稀释至刻度。

2.3 样品处理方法 得到的空白全血或含药全血于3 000 r·min－1低速离心10 min，取上层液即血浆于2 mL离心管中。取空白血浆或含药血浆1.00 mL于10 mL连盖离心管中，分别准确加入50 μL内标液、l mL 0.1 mol·L－1的磷酸盐缓冲液，5 mL 环己烷:正丁醇(95∶5)的混合有机溶液溶液。涡旋振荡2 min，于 4 000·min－1低速离心 5 min，取上层有机相约4.5 mL移至另一离心管中，精密加入TMAH稀释液50 μL，涡旋振荡2 min，40℃氮气流吹干。精密加入100 μL乙腈溶解残余物，涡旋振荡5 min。复溶后，吸取混合液过0.22 μm的滤膜后，精密吸取 20 μL，进样分析。

2.4 专属性试验 取空白血浆1 mL置10 mL连盖离心管中，除不加内标外，按“2.3”项下方法操作，获得空白血浆样品的色谱图，如图1A;将一定浓度的丙泊酚标准溶液和内标溶液混合液进样分析，得色谱图1B;将此混合液加入空白血浆中，按“2.3”项下方法操作，得色谱图1C。内标物和标准品的出峰时间分别为6.2 min和20.8 min;取麻醉手术患者静注丙泊酚 (得普利麻，英国阿斯利康公司)后收集的血浆样品，按照“2.3”项下方法操作，得色谱图1D。结果表明，空白血浆中内源性物质不干扰丙泊酚及内标的测定，本方法具有较高的专属性。

2.5 标准曲线的制备 在10 mL的连盖离心管中分别加入950 μL空白血浆，再加入丙泊酚系列浓度标准溶液50 uL，使血药浓度相当于 25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098 mg·L－1。按“2.3”项下方法操作，以丙泊酚峰面积与内标峰面积的比值X为横坐标，丙泊酚的血药浓度C为纵坐标进行线性回归，求得回归方程为C=1.5975X－0.0294(r=0.999 8)。

丙泊酚的血药浓度在0.098～25 mg·L－1范围内与峰面积有良好的线性关系。丙泊酚的定量下限为0.098 mg·L－1(S/N=3)。

2.6 精密度及回收率 在950 μL空白血浆中分别加入低、中、高3种浓度的丙泊酚标准溶液50 μL，使其浓度分别为0.20，1.56，12.50 mg·L－1，每种浓度6份，按“2.3”项下方法操作，将丙泊酚峰面积与内标峰面积之比X代入标准曲线计算丙泊酚血药浓度，以测得值与加入值之比计算方法回收率。以1 d内测得的丙泊酚血药浓度计算日内精密度，以连续测定3 d，每天1次测得的丙泊酚浓度计算日间精密度。结果见表1。

表1 丙泊酚回收率与日内、日间精密度(±s)

表1 丙泊酚回收率与日内、日间精密度(±s)

加入量/mg·L－1测得量/mg·L－1 RSD/%相对回收率/%日内0.20 0.18 ±0.089 5.05 89.68 ±0.049 1.56 1.55 ±0.016 1.13 98.84 ±0.011 12.50 12.23 ±0.40 3.25 98.99 ±0.022日间 0.20 0.17 ±0.013 7.43 89.33 ±0.031 1.56 1.61 ±0.018 1.09 102.98 ±0.011 12.50 11.75 ±0.68 5.79 93.98 ±0.029

3 讨论

3.1 内标的选择 文献报道多采用麝香草酚蓝［1，5－7，9］为内标物，偶见 2，4 － 二叔丁基苯酚［3］、卡马西平［8］、乙基罂粟碱［10］等做内标。本实验最初选取麝香草酚蓝作为内标，但是通过调整流动相比例、更换流动相等色谱条件不能实现同时将内标物、丙泊酚、血浆中的内源性基质分离的目标。经过尝试，最终选取卡马西平作为内标。

3.2 样品预处理方法的选择 文献报道的丙泊酚血样的预处理方法主要有液液萃取法［4，7，9］和蛋白沉淀法［5－6］。本实验分别尝试了用甲醇、乙腈及二者的混合液作为沉淀剂沉淀蛋白，但发现回收率偏低。在液液萃取方面，尝试了用环己烷［4］、环己烷:正丁醇(95∶5)混合液［7］、氯仿—乙酸乙酯混合液［9］，最终确定萃取剂为环己烷:正丁醇(95∶5)的混合有机溶液溶液。

3.3 流动相的选择 文献报道的流动相组成有乙腈∶水(60∶40，pH2.3)［1］、乙腈∶水(69∶31，pH 4.0)［3］、甲醇∶水(75∶25)［4］、乙腈∶水(65∶36)［5］、乙腈:0.01 mol·L－1磷酸二氢钾水溶液(70∶30，磷酸调 pH 值到 4)［6］、乙腈∶水(70∶30，其中水相加 1%的三氟乙酸调 pH 值到 4)［7］、甲醇∶水(68∶32)［8］等。文献报道的均为等度洗脱，本实验原本使用的流动相是乙腈∶水(其中水相加1%的三氟乙酸调pH值到4)进行等度洗脱，但是不论怎样调整流动相比例，均无法获得良好的分离效果。当有机相比例较高(超过50%)时，血浆中的内源性基质和内标集中在前5 min出峰，不能将内标物与血浆中的内源性基质分开;降低有机相比例虽能将内标物、丙泊酚、血浆中的内源性基质分开，然而此时丙泊酚出峰时间太长(超过30 min)。经过反复的摸索和尝试，最终确定流动相为乙腈/甲醇混合液(乙腈—甲醇按80∶20(V/V)的比例配制，作为有机相)—水(水相加1%的三氟乙酸调pH值到4)，进行二元梯度洗脱，0 ～7 min(50∶50，V/V)，7 ～9 min(50∶50 ～70∶30，V/V)，9 ～22 min(70∶30，V/V)，在低浓度条件下也可获得较好的洗脱效果，内标和药物出峰时间合理，色谱峰形理想。这是文献中首次出现梯度洗脱法测定血浆中的丙泊酚浓度。本方法简便、准确、重现性好，可以满足丙泊酚临床药动学研究的需要。

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