没药甾酮对胆管癌RBE细胞移植瘤生长和miRNA表达谱的影响

仲 飞，童铸廷，范璐璐，姚梦群，孙国平

(安徽医科大学第一附属医院，安徽合肥 230022)

小分子RNA(microRNA，miRNA)是一类广泛存在于动物和植物等多细胞生物中约22个核苷酸左右的非编码单链小分子RNA，它们通过介导转录后基因沉默，在生物许多重要的功能基因网络中起着重要调控的作用［1］。没药为印度传统草药，数千年来被用作香料、食品、化妆品和药品［2］。现代研究表明，没药甾酮(Guggulsterone)是没药中主要生物活性成分之一，具有多种药理活性，如抗炎、抗氧化、降血脂、抗肿瘤、改善认知行为等［3］。但没药甾酮抗肿瘤机制是否涉及miRNA尚无报道，本研究观察了没药甾酮对胆管癌RBE细胞株移植瘤生长的影响，同时利用基因芯片技术检测没药甾酮对移植瘤miRNA表达谱的影响，筛选得到差异表达的miRNAs，深化了对没药甾酮抗肿瘤机制的认识。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 21只6～7周龄健康雌性SD大鼠，质量150～170 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号:SYXK(皖)2005－02。饲养于SPF动物实验室。人胆管癌RBE细胞株购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。没药甾酮为美国Sigma公司产品。Trizol购自美国Invitrogen公司，GeneChip®miRNA芯片及试剂盒为美国Affymetrix公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与处理 收集对数生长期的RBE细胞，PBS漂洗，RPMI1640培养基(不含血清)重悬细胞，调整细胞数至1 ×1010·L－1，每只 0.8 mL 右侧后腿皮下注射，建立动物移植瘤模型。移植后72 h后，动物按完全随机原则均分为3组:高剂量实验组、低剂量实验组与空白对照组。高、低剂量实验组大鼠分别予 40、20 mg·kg－1·d－1没药甾酮，灌胃给药，对照组大鼠灌胃给予等量生理盐水。每5 d测量裸鼠质量和肿瘤体积，处理30 d后取材。

1.2.2 肿瘤体积检测 游标卡尺测量肿瘤长、短径，计算肿瘤体积，公式:V(cm3)=长径×短径2×0.5。

1.2.3 肿瘤组织总RNA的提取 高剂量实验组和对照组每组取4只大鼠，每只鼠剪取肿瘤组织0.1 g，制备组织匀浆，进行标本混样，Trizol试剂常规抽提总RNA。每个样品取1 μL，双蒸水稀释200倍后用核酸蛋白定量仪测定RNA含量与纯度，要求总RNA样品的OD 260/280＞1.8，OD 260/230＞1.5。

1.2.4 miRNAs表达谱的检测 使用 60 ～100 μg总RNA，miRNA Isolation Kit分离 miRNA，使用 Poly(A)聚合酶加尾，T4 RNA连接酶将其与带生物素标记的信号分子连接、标记，后将miRNA溶于含25%甲酰胺的100 μL 6 ×SSPE 缓冲液(0.90 mol·L－1NaCl，60 mmol·L－1Na2HPO4，6 mmol·L－1EDTA，pH 6.8)进行杂交，于38℃与微阵列杂交过夜。杂交结束后，微阵列玻片于40℃下用2×SSC漂洗6 min，甩干后，GenePix 4000B双通道激光扫描仪进行扫描，采用 SignificanceAnalysisofMicroarrays(SAM，version 2.1)软件分析有统计学意义的差异表达位点。表达谱检测由杭州联川生物科技有限公司完成。

1.3 统计学处理 SPSS 13.0统计软件分析数据。三组之间裸鼠质量及肿瘤体积的不同时间点比较采用重复测量的方差分析，两两比较采用Bonferroni法，两组miRNA芯片结果采用t检验进行分析，P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 没药甾酮对裸鼠移植瘤生长的抑制作用 各组大鼠饲养期间生长状态良好，移植瘤成瘤率100%，各组鼠间质量差异无显著性。没药甾酮高、低剂量实验组肿瘤体积分别在处理20 d和25 d后显著低于对照组，提示没药甾酮干预抑制了移植瘤生长;作用25 d和30 d后，高剂量组移植瘤体积显著低于低剂量实验组，说明没药甾酮抑瘤作用呈剂量依赖性，见图1。

2.2 没药甾酮对移植瘤miRNA表达谱的影响高剂量实验组和对照组移植瘤组织进行miRNAs表达谱的基因芯片检测分析，结果表明两组间表达水平具有显著差异的miRNAs有18个，其中较对照组显著上调的有11个，显著下调的有7个。见表1。

表1 没药甾酮对移植瘤组织miRNAs表达的影响

3 讨论

没药原产印度，为橄榄科植物没药树树干皮部渗出的油胶树脂，作为药用已有数千年历史，很早就传入我国，古代中医典籍中对其多有记载。没药甾酮是没药中主要生物活性成分之一，具有多种药理活性，近年来其抗肿瘤作用逐渐引起关注［4］。实验证明，没药甾酮对多种肿瘤细胞有明显的抑制增殖、诱导分化或凋亡、降低侵袭转移等作用，其抗肿瘤机制涉及多条细胞内分子信号通路，包括:Nrf2，NF-kB，STAT3，和 AP-1，MAPKs，PI3K/Akt等［4－10］。但是，这些机制相对分散，不同研究者的结果难以互相印证，因而有必要更深入的研究其抗肿瘤的关键机制，进而发现新的治疗靶点及疗效预测指标，充分开发利用没药甾酮的抗肿瘤潜力。

研究表明，miRNA家族是基因表达调控网络中的关键因子，每个miRNA可能调控着数百个基因的表达，一个基因的表达又可能受多个miRNA的调控，提示miRNA可能以网络的形式参与调控所有信号通路［1］，并有研究提示miRNA在多种肿瘤的发生发展中起重要作用［11－13］。那么miRNA在没药甾酮的抗肿瘤作用中发挥怎样的作用呢?

本实验首次报道了没药甾酮在体内对胆管癌移植瘤有抑制作用，同时伴随着miRNAs表达谱的改变，这提示没药甾酮可能通过调节miRNAs的表达进而影响某些关键靶蛋白的活性从而起到抗瘤作用。我们初步分析了药物处理前后肿瘤组织中表达水平具有显著差异的18个miRNAs，发现其中某些miRNAs具有重要的生物学功能，与肿瘤发生发展密切相关，例如:miRNA-21是一个明确的肿瘤相关基因［14］，其可以通过调节多条细胞信号转导途径来影响肿瘤的生物学行为，没药甾酮完全可能通过下调miRNA-21来发挥抗肿瘤作用。进一步的研究将采用实时定量PCR技术对表达差异明显的miRNAs进行验证，结合生物信息学与实验生物学方法对miRNAs可能在没药甾酮抗胆管癌中作用进行深入探讨。

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