宁夏回汉族KCNQ1基因多态性与2型糖尿病的相关性研究

刘 英，周 英，杨海燕，张海娜，谢晓敏，杨 泽

(1.复旦大学附属浦东医院，上海 201300;2.宁夏医科大学第二附属医院，宁夏银川 750001;3.卫生部北京老年医学研究所，北京 100730)

2型糖尿病在中国是一项重大的公共卫生问题，在我国成年人中的发病从1980年的1.0%增加到2001年的5.5%，发展非常迅速，最近报道我国糖尿病发病率已经增加到9.7%［1］，人群具有较强的2型糖尿病遗传易感性，因为它们更集中和突出的反映出了肥胖者的胰岛素分泌异常。因此，中国可能代表亚洲人口确定2型糖尿病易感基因的很好的资源，在中国人群中进行糖尿病易感基因的研究更具有意义。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种。单核苷酸多态性的研究已广泛应用于遗传性疾病，尤其是多基因遗传性疾病易感基因的研究及精确定位中。Hiroyuki等［2］为首的日本研究小组，运用全基因组关联研究(Genome－Wide Association Studies，GWAS)方法，发现了2型糖尿病新的易感基因 KCNQ1全基因组关联研究(Genome－Wide Association Studies，GWAS)发现KCNQ1基因与T2DM和胰岛素分泌受损相关，KCNQ1基因抑制通过阻断钾离子通道刺激胰岛素分泌，KCNQ1可能发挥胰岛素分泌的作用。近年来中国、韩国、日本、新加坡、丹麦发现KCNQ1多个单核苷酸多态性 (SNP)与2型糖尿病相关各个研究结果相一致，Rs231362位点在中国北方人中尚未见与T2DM的研究。随着生活水平的提高，宁夏糖尿病患病率5%，居于全国前列［3］。宁夏是回族聚集区，有着特有饮食生活习惯，已成为宁夏地区的高发疾病之一 ，此时从分子水平对宁夏回族该病的遗传背景进行研究，探讨这一地区回族和汉族KCNQ1基因rs231362的多态性与T2DM的关系，对少数民族糖尿病发病的病因及发病机制具有十分重要的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 采用病例对照研究，在签署知情同意的基础上，在宁夏医科大学附属第二医院共选取研究对象336例，其中病例组189例为2009—2010年住院病人，病例组为单独2型糖尿病，单独2型糖尿病定义为:判定标准按照世界卫生组织(WHO)1999年标准诊断。选择空腹大于7.0 mmol·L－1且糖负荷后 120 min血糖大于11.1 mmol·L－1者作为病例组。空腹 12 h后，次晨行OGTT试验，口服75 g葡萄糖，分别于空腹及糖负荷后30、120 min采血，测定空腹及糖负荷30、120 min血糖、胰岛素水平、空腹糖化血红蛋白水平，所有人测定身高、体重、腰围、臀围，腰围为平脐水平的周长，臀围为臀部最宽处周长。排除胰腺炎病史、长期服用糖皮质激素，排除糖尿病并发症，并排除心、脑、肾疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤史，连续三代均为同一民族。病例组按民族分为:回族组96例，男52例，女44例，汉族组95例，男47例，女48例。对照组2009—2010年宁夏医科大学附属第二医院体检中心健康者，在签署知情同意的基础上，既往无血糖异常史，排除胰腺炎病史、长期服用糖皮质激素，排除糖尿病并发症，并排除心、脑、肾疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤史，连续三代均为同一民族。健康体检者146例，其中回族84例，男45例，女41例;汉族60例，男30例，女30例。正常组人群的民族、年龄、性别、身高、体重与2型糖尿病人群比较差异无显著性(P ＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 检测指标 患者临床生化指标:胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FBG)、测餐后2 h血糖(2 hPG)。测量体重及身高计算腰臀比测量腰围、臀围、血压，计算体重指数(BMI)。

1.2.2 基因提取及多态性分析 试剂盒(上海生工)提取 DNA，采用PCR技术检测多态性，应用Primer－5软件完成引物设计，PCR引物序列:上游引物 5＇TAC TGG CAA GTC CCT ATC CTT 3＇，下游引物 5＇ACA ACC TCA AAT CTC GGA ATG 3＇，PCR反应体系:模板DNA 2μL、上下游引物各0.1μL、dNTP 0、2 μL、缓冲液 1 μL、Tag酶 0、2 μL、双蒸水7.5μL。设置PCR反应参数:预变性95℃ 5 min，变性94℃ 30 s，退火57℃ 50 s，延伸72℃ 60 s，终末延伸限72℃ 10 min。共有36循环，再用限制性核酸内切酶NlaⅢ酶切(上海生工)30℃(3～4 h)PCR产物，8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶切产物，溴化乙锭(EB)染色，Gel DOC－2000凝胶成像分析系统(美国Bio－Rad公司生产)显像分析确定KCNQ1基因rs231362的基因型。

1.3 统计学方法 数据分析均在SPSS13.0统计软件下完成，P＜0.05时差异具统计学意义。应用SPSS13.0统计软件。基因型和等位基因频率采用直接计数法，Hardy－Weinberg平衡检验样本的群体代表性，计量资料进行t检验;计数资料用χ2检验。

2 结果

2.1 样本均衡性分析 本研究中病例组与对照组等位基因频率分布比较，病例组和对照组基因型频率符合哈丁温伯格平衡(Hardy－Weinberg，HWE)，证明所选人群该位点的基因型分布具有群体代表性。

2.2 KCNQ1基因rs231362基因分型 用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性方法(RFLPPCR)，扩增KCNQ1基因rs231362基因序列的DNA片段，经限制性内切酶NlaⅢ酶切后得到以下长度片段(见图1)。TT 型:296bp、140 bp、125bp、23bp;TC 型:296 bp、163 bp、140 bp、125bp、23bp;CC 型:296 bp、163 bp、125bp。

2.3 病例组及糖耐量正常组在不同民族中KCNQ1基因rs231362多态位点的基因型及等位基因频率的表现 KCNQ1基因rs231362多态位点的基因型及等位基因频率在糖耐量正常组回族及汉族中差异均无显著性，等位基因C的频率在回族及汉族均较高，见表1。病例组与糖耐量正常组回族与汉族人群KCNQ1基因型及等位基因频率间差异均无显著性，两组基因型频率均以CC纯合子多见，等位基因频率以C为多见。见表2，3。

表1 糖耐量正常组组内KCNQ1基因rs231362基因型和等位基因频率的比较频数/%

表2 2型糖尿病组及糖耐量正常组回族人群KCNQ1基因rs231362多态性分布频数/%

表3 2型糖尿病组及糖耐量正常组汉族人群KCNQ1基因rs231362多态性分布频数/%

2.4 KCNQ1基因rs231362位点多态性与2型糖尿病组各临床生化学指标的关系 KCNQ1基因rs231362多态性与2型糖尿病组回族及汉族人群TC、TG、LDL－C、SBP、NDP、FPG 水平无相关性，与低密度脂蛋白、腰臀比、BMI和腰围可能有关联。见表4。

表4 2型糖尿病组各临床血液生物化学指标与KCNQ1基因rs231362多态性的关系

3 讨论

2型糖尿病是一种异质性的慢性复杂遗传疾病，主要由于胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺乏共同作用所导致的血糖代谢障碍的常见代谢性疾病。全基因组扫描技术出现以来，与2型糖尿病遗传易感性明确相关的候选基因到目前为止已经达到19个，包括KCNQ1基因。从已发现的易感位点看，许多位点等位基因频率存在种族差异，这决定这些基因在不同人群中的人群归因风险性不同。KCNQ1基因全称KQT样电压门控钾通道家族成员1，位于11号染色体短壁11p15.5区域，该基因全长404120 bp，共包含16个外显子，是一种编码电压门控钾通道孔隙形成的亚单位(KvLQT1)，在心脏动作电位复极以及上皮的水和盐运输中起到重要的作用。KCNQ1基因突变会引起遗传性长QT综合征，罗马沃德综合征，耶伟尔和兰格—尼尔森综合征以及家族性心房颤动。人类和动物研究证实，KCNQ1基因突变可以导致钾离子通道的功能障碍，导致心脏长QT间期综合征，先天性耳聋，但是，KCNQ1基因在胰岛细胞和培养的分泌胰岛素的细胞中表达，KCNQ1基因抑制剂通过阻断钾离子通道刺激胰岛素分泌［3－5］，这表明 KCNQ1 基因可能发挥调节胰岛素分泌的作用。2型糖尿病易感变异基因的出现频率与人种有关，而目前的研究主要以欧洲人为主，对其他种族的人群进行基因相关性研究非常重要。KCNQ1基因是首次以亚洲人为对象确定的2型糖尿病的相关易感基因。不同于以往许多被发现的2型糖尿病基因在不同种群中的分布中有巨大差异，且不能得到一致重复验证，调查结果显示，最近两个独立的东亚人群全基因组关联研究［7－8］发现，一个位于KCNQ1基因15内含子40 KB的SNPs与2型糖尿病和胰岛素分泌损害持续相关。近年来，中国、韩国、日本、新加坡、以及丹麦做了大量关于KCNQ1基因的研究，发现KCNQ1的多个SNPs位点与2型糖尿病有关，各个研究基本一致［9－11］。但目前发现的2型糖尿病相关性最强位点位于非编码区，是否在编码区存在相关性更强的变异还不清楚，所以我们必须寻找潜在的基因突变，以及可能直接导致糖尿病发生的致病突变，在本研究中，我们做了KCNQ1基因rs231362病例对照研究，已验证KCNQ1基因在宁夏回族和汉族中发病的作用。

本研究中结果表明KCNQ1基因rs231362位点，在宁夏地区回族与汉族糖耐量正常组中，基因型和等位基因频率间无显著性差异(P＞0.05)，提示KCNQ1基因rs231362多态性不存在民族差异。KCNQ1基因rs231362多态性在病例组中，回、汉族均以等位基因T多见，宁夏地区2型糖尿病发病率与T等位基因与无明显关联，携带CT/TT基因型者高于CC型者的中腰围及体质指数，提示该基因可能与腹型肥胖有关，与血脂代谢异常相关联。综上所述，KCNQ1与宁夏地区2型糖尿病无明显关联，虽然存在多种不确定因素，但考虑到不同种族和地区的人群的遗传易感性的差异，以及2型糖尿病病因的高度异质性，本研究尚存在不足之处，如样本量仍不够大，未考虑基因间相互作用，可能基因间之间的相互作用影响研究结果。在今后的研究中需要把握基因间的相互作用，基因与环境之间可能的相互作用等因素，并进一步扩大样本量进行验证，由于2型糖尿病存在种族异质性，不同种族研究结果存在差异，更为重要的是要开展候选基因的功能学研究，证明核苷酸多态性如何导致表型的改变，从而更深入地揭示2型糖尿病的遗传学病因及发病机制。

［1］Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of Diabetes among Men and Women in China［J］.N Engl J Med，2010，362(12):1090－1101.

［2］Hiroyuki U，Atsushi T，Takahisa K，et al.SNPs in KCNQ1 are associated with susceptibility to type 2 diabetes in East Asian and European populations［J］.Nature Genetics，2008，40(9):1098－1102.

［3］杨正贵，刘 兰，刘秀英，等.银川市城乡居民2型糖尿病患病率及危险因素分析［J］.宁夏医学，2009，31(5):399－400.

［4］Lee MP，Ravenel JD，Hu RJ，et al.Targeted disruption of the Kvlqtl gene causes deafness and gastric hyperplasia in mice［J］.J Clin Invest，2000，106(12):1447－1455.

［5］Casimiro MC，Knollmann BC，Ebert SN，et al.Targeted disruption of the Kcnql gene produces a mouse model of Jervell and Lange－Nielsen syndrome［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(5):2526－2531.

［6］Demolombe S，Franco D，De Boer P，et al.Differential expression of KvLQT1 and its regulator ISK in mouse epithelia［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2001，280(2):C359－ C372.

［7］Unoki H，Takahashi A，Kawaguchi T，et al.SNPS in KCNQ1 are associated with susceptibility type 2 diabetes in East Asian and European populations［J］.Nature Genetics，2008，40(9):1098－1102.

［8］Yasuda K，Miyake K，Horikawa Y，et al.Varinants in KCNQ1 are associated with susceptibility to type 2 diabetes mellitus［J］.Nature Genetics，2008，40(9):1092－1097.

［9］Hu C，Wang C，Zhang R，et al.Variations in KCNQ1 are associated with type 2 diabetes and beta cell function in a Chinese population［J］.Diabetologia，2009，52(7):1322－1325.

［10］Tsai FJ，Yang CF，Chen CC，et al.A Genome－ Wide Association Study Idetifies Susceptibility Variants for Type 2 Diabetes in Han Chinese［J］.PLoSGenet，2010，6(2):e1000847.

［11］Jonsson A，Isomaa B，Tuomi T，et al.A variant in the KCNQ1 gene predicts future type 2 diabetes and mediates impaired insulin secretion［J］.Diabetes，2009，58(10):2409－2413.