HPLC法同时测定大鼠血浆中CYP450酶探针药物氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑浓度

朱冬春，程 钢，孙旭群，苏 涌，吴 娟，夏 泉，许杜娟

(1.安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032;2.安徽医科大学第一附属医院药剂科，安徽合肥 230022)

大多数药物进入机体后，在细胞色素 P450(CYP450)酶催化下发生代谢解毒或者代谢活化，这些需要CYP450酶代谢的药物同时使用，通过影响CYP450酶活性，有可能产生相互干扰［1］，发生药物间相互作用，影响疗效导致用药不良反应［2］。探针药物法即通过考察特异性探针药物的代谢变化，反映相应 CYP450酶的活性，进而评价药物对CYP450酶的影响［3］，对预测可能的药物相互作用有重要价值［4］。CYP450酶由多种亚型组成，传统的单探针药物法，采用一种探针药物，每次反映一个或一组代谢酶的活性，效率较低，很难满足现代研究快速、方便以及经济性的要求;“Cocktail”探针药物法是通过考察多个特异性探针药物的代谢，同时评价多种代谢酶亚型的活性变化，具有快速、经济等特点，成为研究药物相互作用的重要途径［5－9］。CYP2E1、CYP2C9和 CYP3A4是 CYP450酶系中3种重要的亚型，占肝脏CYP450酶总量的一半以上，其活性与多种药物的疗效甚至某些疾病的发生密切相关［10－12］，其中氯唑沙宗是广泛认可的 CYP2E1探针药物，甲苯磺丁脲在体内几乎由CYP2C9介导的单一途径代谢，咪达唑仑也是评价CYP3A4代谢活性最为常用的探针药物，此3种探针药物给药后体内的血药浓度变化特征，可分别反映CYP2E1、CYP2C9和CYP3A4此3种代谢酶亚型的活性［13－14］。但氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑的血药浓度同时测定，文献报道多使用质谱方法，操作复杂，成本较高［15－18］，本实验尝试建立快速、方便的高效液相色谱法，同时测定3种探针药物氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑血浆浓度，为考察3种探针药物在体内的药代动力学变化，以及进一步研究药物相互作用提供参考。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(包括自动进样系统、四元梯度洗脱泵、在线脱气机、柱温箱、DAD检测器和色谱工作站，美国Agilent公司);XW－80A旋涡混合器(上海医科大学仪器厂);HYC－362A药品保存箱(海尔集团);DW－FL270超低温冷藏箱(中科美菱);TGL－185台式高速冷冻离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司);METYLER XP－205电子天平(上海Mettler－Toledo有限公司);FA2004上皿电子天平(上海精科天平);MG－2200型氮吹仪(日本Tokyo RIKAKIKAI)。

1.2 试药 地西泮(批号:1159302)、咪达唑仑(批号:171265－201001)、氯唑沙宗(批号:100364－201302)标准品均购自中国药品生物制品检定所，甲苯磺丁脲(批号:C17589900)德国Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇为色谱纯(Tedia Company，美国)，灭菌注射用水购于四川科伦药业，其余试剂为分析纯。

1.3 动物 健康雄性清洁级 SD大鼠，体重200～240 g，安徽医科大学实验动物中心提供。饲养温度20～25℃，湿度50% ～60%。给予普通饲料，自由饮水，适应性喂养1周后禁食12 h，眶静脉取血，5 000 r·min－1离心，取上清液制得空白血浆。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Dikma Diamonsil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相:甲醇与 pH3.45磷酸二氢铵(0.05 mol·L－1)按 61∶39(V/V)比例配制，流速:1 mL·min－1，进样量40 μL，柱温35℃，波长230 nm，带宽4 nm。

2.2 对照品溶液和内标溶液的制备 精密称取氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪达唑仑以及内标地西泮标准品各25 mg，分别置于25 mL的量瓶中，加甲醇制成1 g·L－1对照品储备溶液。取1 g·L－1的地西泮溶液1 mL，加入50 mL容量瓶中甲醇定容，得到20 mg·L－1的内标工作溶液;各取配制好的1 g·L－1氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪达唑仑对照品溶液2.5 mL，加入25 mL容量瓶中甲醇定容，即得100 mg·L－1的混合探针甲醇储备溶液。

2.3 血浆样品的制备与处理 取对照品的甲醇溶液，氮气吹干，加入大鼠血浆100μL，涡旋震荡2 min，即制备成相应浓度的血浆样品。在血浆样品100μL中加入内标溶液10μL(地西泮20 mg·L－1)，涡旋涡旋震荡 2 min，加入三氯甲烷 1.6 mL，涡旋 3 min，12 000 r·min－1离心10 min，吸除上层，取下层有机相1.2 mL于另一试管中，氮气吹干，100μL流动相涡旋3 min复溶，进样40μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性 制备含氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑各2 mg·L－1的对照品混合溶液，氮气吹干后加100μL流动相涡旋3 min复溶，按“2.1”项下方法进样测定，考察标准品色谱图。取含氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑各2 mg·L－1的对照品混合溶液，按“2.3”项下方法血浆处理操作，制备并处理含3种探针药物各2 mg·L－1的血浆样本，按“2.1”项下方法进样测定，考察血浆样品色谱图。另取空白血浆，不加内标，按“2.3”项下血浆处理方法操作，考察空白血浆色谱图。

结果氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、咪达唑仑以及内标地西泮保留时间稳定，药物色谱峰与相邻杂质色谱峰分离良好，色谱结果详见图1。

2.4.2 标准曲线的制备 制取不同浓度的3种探针药物混合甲醇溶液100μL，氮气吹干后加入空白血浆100μL，制备成氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑浓度为 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50 mg·L－1的系列血浆样品，按“2.3”项下方法进行血浆处理操作，HPLC进样测定，测峰面积，以对照品浓度(C)为纵坐标，对照品峰面积与内标峰面积比为横坐标(A)，绘制标准曲线并进行线性回归。结果氯唑沙宗标准曲线方程为 C=6.404A+0.033，r=0.999 5，甲苯磺丁脲标准曲线方程为C=8.762A－0.063，r=0.999 5;咪达唑仑标准曲线方程为 C=2.215A+0.023，r=0.999 5。氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑均在0.1～50 mg·L－1的范围内线性关系良好。见图2。

2.4.3 定量下限 取含氯唑沙宗、甲苯磺丁脲与咪达唑仑0.1 mg·L－1的3种探针药物对照品溶液100μL，氮气吹干后加入空白血浆100μL。平行制备3份，按“2.3”项下方法血浆处理，后将3份所得样品混匀，按“2.1”项下色谱条件平行进样分析5次，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑实测浓度分别为(0.118 ±0.011)、(0.113 ±0.011)和(0.116±0.006)mg·L－1。3种成分准确度均在真实浓度的80%～120%之间，且相对标准偏差(RSD)小于20%，因此 0.1 mg·L－1氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑的对照品溶液，符合生物样品的定量分析要求。

2.4.4 精密度试验 取对照品混合溶液制备低、中、高3 种不同浓度(0.4、2、20 mg·L－1)的氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑血浆样品，按“2.3”项下方法样品处理，再按“2.1”项下方法色谱测定。一日内测定5次，在连续的5 d内分别进行平行试验一次，测定各成分在的色谱峰面积与内标峰面积，分别按“2.4.2”项下各标准曲线计算实测浓度，利用Excel软件求算RSD，结果在低、中、高浓度下，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑精密度 RSD为4.78% ～9.78%，符合生物样本测定要求。具体结果见表1。

2.4.5 回收率试验 各取对照品制成低、中、高不同浓度的氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑(0.4、2、20 mg·L－1)的血浆样本，每个浓度5个平行样本，按“2.3”项下方法样品处理，再按“2.1”项下方法色谱测定。按标准曲线计算氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑浓度，实测值与加入值的比值计算回收率。结果3种探针药物的总回收率在92.71% ～109.79%范围内，符合生物样本测定要求。结果见表1。

表1 大鼠血浆中3种探针药物HPLC法测定的精密度与回收率(n=10)

2.5 稳定性试验 考察3种探针药物在保存条件下的稳定性，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑的血浆样品在－20℃中冷冻保存，在10、30 d测定样品中药物浓度，结果样品浓度无明显变化;对照品的甲醇溶液在2～8℃避光冷藏，考察其浓度变化，结果该条件下样品溶液6个月浓度无变化。血浆样品在室温(25±3)℃下放置以及处理后放置24h内稳定。测定结果表明，各样品在相应保存条件下稳定性良好。

3 讨论

血浆药物浓度常用检测方法有气相色谱法、液相色谱法、色谱—质谱联用法等，其中高效液相色谱法操作相对简单，成本较低，使用更为广泛。本研究选用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)联用紫外检测器，探索血浆样本药物浓度的分析方法。对3种探针药物进行全波长扫描，各探针药物在230 nm均有较大紫外吸收。参考药典以及文献中氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑的分析方法［19－20］，并结合其化学结构，理化性质等特点，最终选用甲醇和 0.05 mol·L－1的磷酸二氢铵(pH3.45)溶液作为3种探针药物的色谱流动相，其比例在61∶39时各探针药物、内标与杂质分离良好。

合适的血浆样品前处理对建立准确、可靠的HPLC方法至关重要［21］。常见如有机溶剂沉淀法、液液萃取法和固相萃取法等处理方法。相对于蛋白沉淀法、液液萃取法制备样品内源性杂质少，能更好消除基质效应的影响，且易浓缩处理，适用于低浓度的生物样品分析［22］。本实验采用16倍体积氯仿作为萃取溶剂，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑取得的提取回收率和重现性均符合要求。

本方法操作简便，灵敏度高，快速可靠，适用于同时测定3种CYP450酶亚型探针药物氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪达唑仑的大鼠血浆药物浓度，可为评价大鼠体内CYP2E1、CYP2C9和CYP3A4同工酶活性，以及为药物相互作用研究提供分析方法学参考。

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