人类免疫缺陷病毒耐药检测研究进展

邱宇鹤 何淑云 王 锦

吉林省吉林市疾病预防控制中心，吉林吉林 132001

近年来艾滋病抗病毒治疗工作呈现全球性的迅速发展，接受有效的抗病毒治疗对于抑制病毒复制，降低发病率和死亡率，提高生命质量具有重要意义。但目前人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）耐药已成为抗病毒治疗的重要问题，不仅会影响个体自身治疗，并且会引起耐药毒株传播流行的社会风险。面对HIV耐药现状，开展耐药检测不仅能够指导评估、选择和优化调整临床治疗方案，还能够为分析耐药毒株的流行状况、有效制定公共卫生防治策略提供科学依据。

1 HIV耐药现状

用于艾滋病治疗的抗病毒药物现已发展至6大类［1］，而治疗方案也发展为不同分子靶点的多种药物联合作用，但是耐药的出现严重影响治疗效果，并且随着抗病毒治疗的推广普及，HIV耐药在全球已呈广泛流行趋势。Pham等［2］在2014年的一项系统性研究中指出，2009～2013年中/低收入国家高危人群的耐药率较2004～2008年升高了近一倍，形势非常严峻。更值得重视的是，耐药的发生不止针对一线药物，随着新的抗病毒药物及治疗方案的应用，新的耐药突变也在不断出现，当前HIV耐药已经成为导致抗病毒治疗失败的主要因素［3］。

HIV耐药是指HIV在通常能够抑制其复制的药物存在情况下复制的能力［4］，病毒逆转录酶缺乏校正功能，复制过程中存在高频错误倾向（约3×10-5突变/碱基/复制周期）［5］，而病毒高速复制的特点加速了感染进程中病毒突变的积累，在机体自身免疫和抗病毒药物的选择压力下筛选出耐药优势株。如果患者服药依从性低引起血药浓度波动，会增加发生耐药的危险，对云南德宏州艾滋病患者接受抗病毒治疗后耐药突变情况的研究发现［6］，在353例成功进行耐药相关基因位点突变检测的患者中，有198例（56.1％）发现耐药基因突变。HIV耐药不但会影响患者自身治疗效果，更会引起耐药毒株流行的公共卫生问题。如杨洪等［7］报道2011年我国凉山州未治疗人群原发耐药率为5.43％（7/129），达到中度流行状态。因此有效开展HIV耐药检测对于指导个体治疗和防控HIV耐药传播都具有十分重要的意义。

2 HIV耐药检测方法

2.1 表型耐药检测

表型耐药检测原理是通过检测在体外不同浓度抗病毒药物存在情况下HIV病毒的复制能力，评价病毒对药物的敏感性，结果以所检毒株的50％抑制浓度（50％Inhibitory Concentration，IC50）与作为对照的野生毒株的IC50的倍数改变来表示［8］，适用于复杂多位点的耐药性突变检测，可以用于评估新的抗病毒药物。

作为传统检测方法，外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）共培养法通过p24抗原定量来计算待测毒株的IC50，实验条件要求严格，对于技术和费用的需求标准较高，同时在培养过程中存在诱导出耐药优势株的风险，应用具有局限性。除PMBC外，还有一些细胞系可作为指示细胞，比如稳定表达CD4、CXCR4和CCR5受体的TZM-b1，并且TZM-b1细胞也可以被假病毒所感染［9］。以重组技术为基础的假病毒表型耐药检测是将扩增的HIV特定区域基因插入载体，用构建的重组病毒进行检测。目前商品化的检测试剂盒主要有：AntivirogramlTM、PhenoSense GTTM和PhenoscriptTM。假病毒表型耐药检测具有较高的安全性，过程相对较为快捷，能够检测病毒载量较低的样本。徐萌等［10］通过构建40株包含患者基因片段的假病毒对6组不同单药和多药进行表型耐药检测，成功定量评估了样本的耐药水平，而杨婧等［11］对比研究了5种药物的真病毒和假病毒表型耐药检测情况，数据表明两种方法一致性较高，仅有对于齐多夫定的一个检测结果存在耐药程度的不同，其结果为假病毒表型耐药检测推广应用的适宜性提供了更多的支持。

2.2 基因型耐药检测

基因型耐药检测基于分子生物学方法，扩增基因组中耐药相关的特定区域目的基因片段并进行序列测定，利用数据库进行结果解释，操作简单，所用时间短。标准的基因型耐药检测的对象主要是蛋白酶和逆转录酶区域，随着更多不同靶向药物如整合酶抑制剂、CCR5拮抗剂等的应用，检测范围也在不断拓展［12］。Kagan等［13］在CCR5/CCR2双重拮抗剂的临床Ⅱ期试验中比较了基因型和表型耐药检测，发现二者具有较高的一致性，而基因型耐药检测在检测周期和成本上具备优势。

常用的HIV耐药基因型检测商品化试剂盒有TRUGENETM和ViroSeqTM，具备对应的耐药数据库，检测成本昂贵。实验室自建的In-house方法一般用巢式PCR方法进行扩增，结果分析常用斯坦福大学耐药数据库（Stanford HIVdb），在常规化推广中表现出更好的性价比［14］。李晶等［15］对In-house方法和TRUGENETM、ViroSeqTM两种商品化试剂盒的检测结果比较研究发现，三种方法的一致率达到99.42％（2933/2950）。病毒载量达到1000拷贝/毫升被认为是推荐进行耐药检测的阈值，但对低水平病毒血症的患者开展耐药检测正在逐渐引起更多的重视。Gonzalez-Serna等［16］的研究显示，采用实验室自建方法，病毒载量在50～249拷贝/毫升之间的样本成功率为74％，大于250拷贝/毫升的成功率可以达到90％。

目前用于基因型耐药检测的样本主要为抗凝全血或血浆，但对于样本的保存运输条件要求较高。以滤纸作为载体的干血斑（Dried blood spots，DBS）样本具备易采集处理、危险性低、便于储存运输、费用低廉的优势，适合在资源环境条件有限的地区推广应用［17］。马鹏飞等［18］研究发现，应用实验室自建方法，36份样本中DBS的耐药检测结果有31份与血浆相比完全一致（86％）。但滤纸载体样本也存在样本量小、对于低病毒载量的患者检测不准确等问题，WHO HIV耐药实验室策略［19］中指出，干血浆斑（dried plasma spot，DPS）和干血清斑（dried serum spot，DSS）样本不适合于耐药监测调查。

2.3 虚拟表型耐药检测

作为新型耐药检测方法的虚拟表型耐药检测在2001年由Graham等报道［20］，其原理是通过将基因型检测结果的序列信息提交基因型-表型匹配的大容量数据库，通过数据比对鉴别出与患者所带毒株相似的基因型，评估其对应的表型信息的平均IC50，以分析所测毒株的可能表型。Jiamsakul等［21］研究显示，基于Stanford HIVdb的基因型和基于vircoTYPETM的虚拟表型耐药检测结果具有高度一致性。前文的Gonzalez-Serna等［16］也使用了虚拟表型方法进行重复分析，获得了非常相似的结果。虚拟表型耐药检测本质上是对基因型耐药检测结果的二次分析，是建立在实验室的具体检测结果上的一种间接性预测，与表型耐药检测相比检测成本低，显著节约工作时间，已经在美国、欧洲等推荐使用［22］，比如McFaul等［23］用虚拟表型方法有效评价了2011～2013年在伦敦未治疗HIV感染人群中的的耐药流行情况。

3 HIV耐药检测的应用

HIV耐药检测对于个体抗病毒治疗和公共卫生层面的艾滋病防控工作意义重大。在临床工作中，耐药检测能够指导临床医生对于患者进行科学管理，优化治疗方案，提高抗病毒治疗质量。相对应的是在治疗药物的选择上，具备高耐药屏障的药物如整合酶抑制剂度鲁特韦与其他药物的联合使用也更加受到关注［24］。我国艾滋病诊疗指南［25］推荐在抗病毒治疗病毒载量下降不理想或抗病毒治疗失败需要改变治疗方案时，和条件允许时在抗病毒治疗前，进行HIV基因型耐药检测。美国成人及青少年艾滋病抗病毒治疗指南［1］建议对于已知或可能存在复杂耐药突变位点，特别是蛋白酶抑制剂耐药的情况下，联合使用表型和基因型耐药检测。Luz等［26］在巴西的研究指出，在抗病毒治疗开始前的基因型耐药检测能够延长预期寿命和节约成本，获得更高的健康收益。

在公共卫生领域，开展耐药检测有助于研究人员掌握HIV耐药毒株的流行状况、传播趋势和变化规律，科学有效的评估和应对HIV耐药风险。我国自2005年开始对HIV耐药检测方法进行室间平行比对，至2009年已有19个省23家省市级实验室参加，累计提交的95份结果显示97.7％总序列阳性率，78.9％耐药位点判读完全一致率，76.8％序列编辑分析一致率，检测能力和质量总体不断提高［27］。考虑到直接来源于临床样本的考核品在安全性和稳定性等方面要求严格，罗慧景等［28］提出将包含耐药目的基因的重组质粒作为基因型能力验证考核品，能够达到反复冻融5次以上而保持稳定性。HIV耐药检测是耐药监测工作的重要内容，在确保耐药检测质量，提升检测技术的基础上，将HIV耐药检测与流行病学调查相结合，有效分析耐药相关影响因素，可以为完善HIV耐药的预防和控制策略提供参考，如肖占沛等［29］对江苏省艾滋病患者耐药及影响因素的调查研究结果显示，不稳定的居住状况和低收入水平可能作为服药依从性的相关因素影响耐药，提示需要对于此类型重点人群给予更多的关注和干预。因此，做好HIV耐药检测工作，能够为降低HIV耐药的发生、传播和流行，加强艾滋病防治工作提供科学指导和支持。

［1］Panel on Antiretroviral Guidelines for Adults and Adolescents.Guidelines for the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents［EB/OL］.Department of Health and Human Services，2014.http∶//aidsinfo.nih.gov/ContentFiles/AdultandAdolescentGL.pdf.

［2］Pham QD，Wilson DP，Law MG，et al.Global burden of transmitted HIV drug resistance and HIV-exposure categories：a systematic review and meta-analysis［J］.AIDS，2014，28（18）：2751-2762.

［3］Pennings PS.HIV drug resistance：problems and perspectives［J］.Infect Dis Rep，2013，5（Suppl 1）：21-25.

［4］World Health Organization.The HIV drug resistance report-2012［M］.World Health Organization，2012.

［5］Cortez KJ，Maldarelli F.Clinical management of HIV drug resistance［J］.Viruses，2011，3（4）：347-378.

［6］Yao S，Yang J，Zhou L，et al.Study on HIV viral load in plasma and drug resistance among AIDS patients receiving antiretroviral treatment in Dehong prefecture，Yunnan province［J］.Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2014，35

（4）：411-416.

［7］杨洪，苏玲，王启兴，等.凉山州部分彝族人群2011年HIV耐药警戒线监测研究［J］.中国艾滋病性病，2015，21（1）：28-30.

［8］Tang MW，Shafer RW.HIV-1 Antiretroviral Resistance［J］.Drugs，2012，72（9）：e1-e25.

［9］Guo W，Li H，Zhuang D，et al.Impact of Y181C and/or H221Y mutation patterns of HIV-1 reverse transcriptase on phenotypic resistance to available non-nucleoside and nucleoside inhibitors in China［J］.BMC Infect Dis，2014，14：237.

［10］徐萌，绳波，袁霖，等.新型HIV-1表型耐药系统临床检测应用研究［J］.中国病毒病杂志，2014，49（4）：285-292.

［11］杨婧，耿文清，张旻，等.HIV-1基因型，假病毒表型与活病毒表型耐药检测结果的比较［J］.中华实验和临床感染病杂志（电子版），2014，8（3）：308-313.

［12］Dunn DT，Coughlin K，Cane PA.Genotypic resistance testing in routine clinical care［J］.Curr Opin HIV AIDS，2011，6（4）：251-257.

［13］Kagan RM，Johnson EP，Siaw MF，et al.Comparison of genotypic and phenotypic HIV type 1 tropism assay：Results from the screening samples of Cenicriviroc Study 202，a randomized phase II trial in treatment-naive subjects［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2014，30（2）：151-159.

［14］Chaturbhuj DN，Nirmalkar AP，Paranjape RS，et al.Evaluation of a cost effective In-House method for HIV-1drug resistance genotyping using plasma samples［J］.PLoS One，2014，9（2）：e87441.

［15］李晶，蒋岩，吕超，等.三种HIV-1基因型耐药检测方法的一致性评价［J］.中华预防医学杂志，2013，47（11）：1050-1055.

［16］Gonzalez-Serna A，Min JE，Woods C，et al.Performance of HIV-1drug resistance testing at low-level viremia and its ability to predict future virologic outcomes and viral evolution in treatment-naive individuals［J］.Clin Infect Dis，2014，58（8）：1165-1173.

［17］Monleau M，Aghokeng AF，Eymard-Duvernay S，et al.Field evaluation of dried blood spots for routine HIV-1 viral load and drug resistance monitoring in patients receiving antiretroviral therapy in Africa and Asia［J］.J Clin Microbiol，2014，52（2）：578-586.

［18］马鹏飞，邢辉，廖玲洁，等.干血斑用于HIV-1耐药基因型检测的研究［J］.中华预防医学杂志，2010，44（11）：993-998.

［19］World Health Organization.WHO/HIVResNet HIV drug resistance laboratory strategy［M］.World Health Organization，2010.

［20］Graham N，Peeters M，Verbiest W，et al.The virtual phenotype is an independent predictor of clinical response［C］.Program and abstracts of the 8th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections，2001：4-8.

［21］Jiamsakul A，Kantor R，Li PC，et al.Comparison of predicted susceptibility between genotype and virtual phenotype HIV drug resistance interpretation systems among treatment-naive HIV-infected patients in Asia：TASER-M cohort analysis［J］.BMC Res Notes，2012，5：582.

［22］Lengauer T，Pfeifer N，Kaiser R.Personalized HIV therapy to control drug resistance［J］.Drug Discov Today Technol，2014，11：57-64.

［23］McFaul K，Lim C，Jones R，et al.Transmitted antiretroviral drug resistance in treatment nave HIV-infected persons in London in 2011 to 2013［J］.J Int AIDS Soc，2014，17（Suppl 3）：19747.

［24］Cruciani M，Malena M.Combination dolutegravir-abacavir-lamivudine in the management of HIV/AIDS：clinical utility and patient considerations［J］.Patient Prefer Adherence，2015，9：299-310.

［25］中华医学会感染病学分会艾滋病学组.艾滋病诊疗指南（2011版）［J］.中华传染病杂志，2011，29（10）：629-640.

［26］Luz PM，Morris BL，Grinsztejn B，et al.Cost-Effectiveness of Genotype Testing for Primary Resistance in Brazil［J］.J Acquir Immune Defic Syndr，2015，68（2）：152-161.

［27］邢辉，廖玲洁，钟平，等.中国2007-2009年HIV-1耐药基因型检测质量评估结果［J］.中国艾滋病性病，2012，18（4）：206-209，217.

［28］罗慧景，李晶，范文成，等.HIV-1基因型耐药检测能力验证考核品的制备和评估［J］.中国病毒病杂志，2015，5（1）：22-26.

［29］肖占沛，宏雄，还锡萍，等.江苏省艾滋病患者HIV-1耐药株的流行及影响因素研究［J］.南京医科大学学报（自然科学版），2012，32（9）：1314-1319.