莫诺苷对脑缺血再灌注大鼠皮层梗死周边区基质金属蛋白酶表达的影响①

侯虹丽，孙芳玲，艾厚喜，张丽，王文

莫诺苷对脑缺血再灌注大鼠皮层梗死周边区基质金属蛋白酶表达的影响①

侯虹丽1，孙芳玲2，艾厚喜2，张丽2，王文2

目的研究莫诺苷对大鼠脑缺血再灌注3 d皮层梗死周边区基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9表达的影响。方法健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠15只随机分为假手术组(n=3)，模型组(n=3)，莫诺苷小剂量组(n=3)、中剂量组(n=3)及大剂量组(n= 3)。采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)30 min再灌注模型。术后3 h，莫诺苷各组予莫诺苷30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃。术后3 d，免疫组化染色观察脑缺血皮层梗死周边区MMP-2、MMP-9表达。结果与假手术组比较，模型组皮层梗死周边区MMP-2、MMP-9表达明显著升高(P＜0.01)。与模型组比较，莫诺苷各组MMP-2、MMP-9表达明显降低(P＜0.01)。结论莫诺苷能降低大鼠脑缺血再灌注3 d皮层梗死周边区MMP-2、MMP-9的表达，从而保护血脑屏障功能。

脑缺血再灌注；莫诺苷；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；大鼠

[本文著录格式]侯虹丽，孙芳玲，艾厚喜，等.莫诺苷对脑缺血再灌注大鼠皮层梗死周边区基质金属蛋白酶表达的影响[J].中国康复理论与实践,2015,21(1):5-8.

CITED AS:Hou HL,Sun FL,Ai HX,et al.Effects of morroniside on expression of matrix metalloproteinases in peri-infarct cortex after cerebral ischemia-reperfusion in rats[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2015,21(1):5-8.

缺血性脑卒中是由于脑血管内发生血栓、栓塞或其他原因导致脑供血不足而引起的脑血管疾病[1-2]。脑卒中后急性期，除了细胞死亡外，另一个非常重要的损伤机制是神经血管单元损伤，这种损伤已被证明可破坏血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的功能[3-4]。血脑屏障是由脑血管内皮细胞、基底膜和星形细胞等组成的复杂系统，是维持脑内微环境的重要结构，其通透性与中枢神经的损伤、炎症等有密切关系[5]。脑缺血再灌注后血脑屏障的结构和功能遭到破坏[6]：结构破坏主要表现为包绕微血管的胶质细胞发生肿胀和退行性改变、毛细管内皮细胞特性改变等；功能改变主要表现为通透性改变。血脑屏障的通透性改变与缺血后再灌注的时间密切相关。缺血再灌注3 h，血脑屏障的通透性开始增加；再灌注24 h，血脑屏障通透性升至高峰，维持至48 h；再灌注72 h以后血脑屏障的通透性逐渐减小[7]。因此，在脑缺血再灌注损伤中，抓住血脑屏障的3 h治疗窗，对脑卒中的治疗意义深远。

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是分解细胞外基质的蛋白酶类中最重要的一类，在生

理和病理过程中均发挥重要作用。其中，MMP-2和MMP-9是MMPs家族中的重要成员，它们作为最重要的细胞外基质降解酶，与血脑屏障损伤关系最为密切[8]。目前研究认为，MMP-2的表达与脑缺血再灌注后早期血脑屏障的开放有关，而MMP-9与缺血再灌注后血脑屏障的第2次开放有关[9]。MMP-2、MMP-9激活后，参与降解血脑屏障基膜的主要成分，促使血脑屏障开放，破坏脑保护屏障，引起血脑屏障的通透性增加，造成进一步损伤[10]。

莫诺苷是我们从山茱萸中提取的环烯醚萜苷类重要单体成分。我们的前期研究除了验证莫诺苷体外抗氧化和抗凋亡的功能外[11-12]，体内试验表明，莫诺苷能减小局灶性脑缺血损伤模型大鼠的大脑梗死体积，促进神经功能的恢复[13]。本研究中我们对莫诺苷调节MMPs的活性，发挥神经保护作用进行研究，为脑卒中治疗药物的研发提供实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及给药

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠15只，体重260～280 g，由北京维通利华实验动物中心提供，许可证号：SCXK(京)2006-0009。12 h昼夜循环清洁级饲养，预适应环境1周后进行实验。将大鼠编号1～15，用随机数字表法分为假手术组，模型组，莫诺苷小、中、大剂量组，共5组，每组3只。

莫诺苷由本实验室从中药山茱萸的干燥成熟果肉中提取。高效液相色谱仪对组分进行分析，纯度98.5%。使用时将其溶于蒸馏水。术后3 h开始，莫诺苷小、中、大剂量组按30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg每天1次灌胃给药。假手术组和模型组予等体积蒸馏水。

1.2 主要仪器和试剂

尼龙栓线，直径0.26 mm(2634-100)：北京沙东生物技术有限公司。Thermo Scientific轮转式切片机：上海莱卡仪器有限公司。Olympus BX51显微镜：日本OLYMPUS光学工业株式会社。MMP-2抗体：武汉博士德生物工程有限公司。MMP-9抗体：美国SANTA CRUZ公司。DAB显色试剂盒：上海基因科技有限公司。

1.3 模型制备

参考Longa线栓法[14]制作大鼠大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。大鼠造模前一晚禁食，自由饮水。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。仰卧位固定，颈部消毒，切开右侧颈部，逐层分离暴露右侧颈总动脉、颈外动脉以及颈内动脉，分别结扎右侧颈总动脉及右侧颈外动脉。在颈总动脉近动脉分叉处剪一小口，将线栓插入右侧颈内动脉约18～20 mm，感到轻微阻力时立即停止插线。缝合伤口，抗生素预防感染，留置线头于体外。30 min后拔出尼龙线。

假手术组麻醉后进行相同手术操作，但不插线。

术后控制室温25～30℃，3 h后动物清醒，观察其行为。依据Longa 5分法进行术后行为学评分：0分，正常，无神经功能缺损；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，行走时，向对侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分，行走时，向对侧(瘫痪侧)倾倒，重度神经功能缺损；4分，不能自发行走，有意识丧失。评分1～3分为造模成功，0和4分淘汰。采用差额补充方法补足各组设计所需大鼠数量。

1.4 免疫组织化学染色

1.4.1 脑组织切片

术后3 d，所有大鼠10%水合氯醛20 ml/kg腹腔注射麻醉，固定四肢，快速剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏和主动脉弓。用9号针头插入左心室至主动脉，灌注生理盐水；待右心耳流出液无色透明时，用4%多聚甲醛先快后慢灌注固定，直至动物呈僵硬状态。灌注0.5 h后开颅取脑，将脑组织浸于后固定液中过夜。脑组织冰冻切片，厚40 μm，取前囱前1.60 mm到后0.2 mm，10个切片，每个脑组织选3个切片。

1.4.2 染色

所选切片于新鲜配制的3%H2O2室温孵育10 min；PBST洗3次，每次5 min；滴加5%～10%正常山羊或兔血清，室温孵育30 min，倾去；滴加MMP-2、MMP-9一抗工作液(1∶200)，4℃过夜；PBST洗3次，每次5 min；滴加生物素标记抗兔或鼠二抗工作液，37℃摇床孵育10～30 min；PBST洗3次，每次5 min；滴加适量的辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 min；PBST洗3次，每次5 min；新鲜配制的DAB室温显色5～10 min；水洗，梯度乙醇脱水，卵白素-生物素过氧化物酶联合3,3'-二氨基联苯胺复染，二甲苯透明，中性树脂封片。

1.4.3 图像分析

光学显微镜观察皮层梗死周边区MMP-2、MMP-9阳性细胞。选择梗死区边缘皮层区域3个感兴趣区域(400×300 μm)，用Image-pro Plus图像分析系

统计数MMP-2、MMP-9免疫反应阳性细胞积分光密度(IOD)值。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 MMP-2

MMP-2免疫组化阳性细胞呈星形胶质细胞状表达(图1)。模型组MMP-2阳性细胞表达比假手术组显著升高(P＜0.001)；莫诺苷各组MMP-2表达较模型组显著降低(P＜0.001)。见表1。

2.2 MMP-9

MMP-9免疫组化阳性细胞呈神经元细胞状表达(图2)。模型组MMP-9阳性细胞表达比假手术组明显升高(P＜0.01)；莫诺苷各组MMP-9表达较模型组明显降低(P＜0.01)。见表1。

表1 各组术后3 d皮层梗死周边区MMPs表达(IOD)

图1 各组术后3 d皮层梗死周边区MMP-2表达(免疫组化染色，40×)

图2 各组术后3 d皮层梗死周边区MMP-9表达(免疫组化染色，40×)

3 讨论

脑卒中后MMPs对血脑屏障的损伤起着决定性作用[15]，MMPs与缺血性脑卒中的形成、发展以及预后的关系已成为近年来研究的热点。在正常状态下，MMPs的活性被控制在较低水平；但在生理及病理条件下，MMPs过度激活，使细胞外基质降解并且导致外周血管损伤[16]。MMP-2、MMP-9的激活促使血脑屏障开放，引起血脑屏障的通透性增加。

脑卒中患者和大鼠局灶性脑缺血模型中，MMPs表达都显著增加[17]。周进研究显示，MMP-2在缺血再灌注大鼠脑中表达上调，并与再灌注早期血脑屏障的开放及后期组织修复即血管生成有关[18]。Asahi等研究显示，脑缺血模型MMP-9表达明显增加；而敲除MMP-9基因能减轻脑梗死过程中的脑损伤，显著减少脑梗死区面积，具有脑保护作用[19]。MMP-9在脑缺血发作24 h至数月内被激活，而MMP-2激活由于需要TLMP-2的参与，一般在脑缺血后2～5 d表达增加[15]。

本研究显示，脑缺血再灌注损伤后3 d，缺血侧皮层梗死周边区MMP-2和MMP-9表达均上调，与已有报道一致[20-21]。表明MMPs在缺血性脑卒中发病早期参与到脑缺血损伤的病理机制中，并在时间顺序上反映出MMPs的合成在神经细胞继发性死亡中的重要

作用。给予莫诺苷治疗后，MMP-2和MMP-9表达明显降低。我们推测，莫诺苷在脑卒中后早期的神经保护作用机制之一可能是下调MMPs。

莫诺苷对MMPs的作用可能不同于MMPs抑制剂。啮齿类脑缺血模型研究表明，由于MMPs与血管形成有关，因此MMPs抑制剂会阻断或减慢脑卒中后神经修复，其保护作用在缺血后48 h失效[22]。

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Effects of Morroniside on Expression of Matrix Metalloproteinases in Peri-infarct Cortex after Cerebral Ischemia-reperfusion in Rats

HOU Hong-li,SUN Fang-ling,AI Hou-xi,ZHANG Li,WANG Wen.Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China

Objective To study the effects of morroniside on the expression of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 in the peri-infarct cortex 3 days after cerebral ischemia-reperfusion.Methods 15 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group(n=3),ischemia group(n=3),and morroniside groups(low,medium and high dosage groups,n=3).The middle cerebral artery were occluded for 30 min,and re-perfused.Morroniside was administered intragastrically once a day at dose of 30 mg/kg,90 mg/kg and 270 mg/kg 3 hours after operation.The expression of MMP-2 and MMP-9 in peri-infarct cortex were detected with immunohistochemistry staining 3 days after operation.Results The expression of MMP-2 and MMP-9 increased in the ischemia group compared with the sham group(P＜0.01),and it decreased in all the morroniside groups compared with the ischemia group(P＜0.01).Conclusion Morroniside could decrease the expression of MMP-2 and MMP-9 in the peri-infarct cortex 3 days after ischemia,suggesting protecting the function of blood-brain barrier from ischemia.

cerebral ischemia-reperfusion;morroniside;matrix metalloproteinase-2;matrix metalloproteinase-9;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2015.01.002

R743.3

A

1006-9771(2015)01-0005-04

2014-09-09

2014-09-24)

1.“重大新药创制”科技重大专项(No.2012ZX09102201-016)；2.国家自然科学基金项目(No.81173575；No.81373994)；3.北京市教委科技创新平台项目(No.112219)；4.北京市卫生系统高层次卫生技术人才培养计划项目(No.2011-3-097)。

1.河北北方学院，河北张家口市075000；2.首都医科大学宣武医院，北京市100053。作者简介：侯虹丽(1986-)，女，汉族，山西交城县人，硕士研究生，主要研究方向：神经药理，中药药理。通讯作者：王文。E-mail:lzwwang@163.com。