难治性哮喘糖皮质激素抵抗机制的研究新进展

朱莹然(综述)，俞小卫(审校)

(南京医科大学附属常州市第二人民医院呼吸科，江苏常州213003)

哮喘的糖皮质激素抵抗现象最早于1968年被描述，当时发现6例哮喘患者全身大剂量使用糖皮质激素后，临床症状无任何改善且外周血嗜酸粒细胞无明显减少［1］。而在临床实践中，完全对糖皮质激素治疗没有反应的哮喘并不多见，过去定义的激素抵抗性哮喘大部分通过增加激素剂量和延长激素使用疗仍然有治疗效果。随着全球哮喘防治倡议的推广，难治性哮喘的概念逐渐形成，2008年该倡议定义:患者经过全球哮喘防治倡议推荐的第4级治疗方案，即予以两种或两种以上的控制发作药物加缓解期药物治疗，仍不能达到临床接受的病情控制水平，称为难治性哮喘［2］。现就难治性哮喘糖皮质激素抵抗机制的研究新进展予以综述。

1 糖皮质激素受体的改变

糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)属于核受体超家族，位于细胞质内，未与配体结合时，是以多蛋白复合体的形式存在，其伴侣蛋白主要有热激蛋白(heat shock protein，HSP)90、HSP70、免疫亲和蛋白和p23等;当GR与配体结合后，其构象发生改变，从蛋白复合体中解离，在核定位序列的介导下转入核内，以二聚体的形式与糖皮质激素相关基因的反应原件结合，在共激活因子作用下，启动或抑制相应基因的转录而发挥激素的生理作用［3］。GR 有 GRα、GRβ、GRδ、GRγ 4种亚型［4-5］，激素的生理学作用主要由GRα介导。哮喘糖皮质激素抵抗现象的产生可能与GR的多态性、GRα的生理活性以及GR与受体的亲和力下降有关［6-7］。

1.1 GR基因多态性 早在2002年，Bray和 Cotton［8］就总结了人类NR3C1突变与糖皮质激素抵抗的联系，发现涉及GR基因15种错义、3种无义密码子、3种移码、1种结合位点、2种选择性结合突变和16种多态性现象。人类糖皮质激素受体(hGR)基因由9个外显子和8个内含子构成，外显子3和外显子4构成了DNA结合区(DBD)，外显子5到外显子9包含铰链区(LBD);hGR基因的突变主要位于DBD和LBD，特别是LBD;hGR基因的突变和单核苷酸多态性主要通过:①突变GR与配体结合的亲和力下降;②突变GR与糖皮质激素效应元件(glucocorticoid response elements，GRE)的结合能力;③突变GR转录活性的变化;④突变GR与共激活因子GRIP1的异常相互作用，从而影响激素的抗炎作用，产生激素抵抗［9］。

1.2 GR的磷酸化 难治性哮喘患者的肺泡巨噬细胞中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的水平显著升高［10］。人类的MAPK分为4个亚型，即细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated protein kinase，EPK)、c-Jun氨基端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)、ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)、p38MAPK;进一步研究发现，p38MAPK亚型的抑制剂能逆转难治性哮喘患者对激素的敏感性［11］。一方面，细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)2、IL-4和IL-13等能通过激活p38MAPK通路，使GR磷酸化，降低其与配体的亲和力，继而发生激素抵抗;另一方面肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)等其他炎性细胞因子通过激活MAPK-JNK途径使GR磷酸化，从而抑制底物与GRE相结合［12］。MKP1是MAPK的一种内源性抑制剂，实验证实MKP1基因剔除小鼠其地塞米松的抗炎作用明显下降［13］。总的来说，GR被磷酸化后，其与激素和DNA-GRE结合的能力下降、二聚体的稳定性下降、核转移能力减弱以及与上游的信号因子(如转录因子)之间的相互作用能力减弱，导致激素抵抗的发生。

1.3 GRα与GR的比例失衡 GRβ是GRα的内源性拮抗剂，竞争性抑制GRα发挥生物活性，并能直接或通过影响转录因子通路中断GRα的核转移［14］。试验表明，将难治性哮喘患者肺泡巨噬细胞中的GRβ基因剔除后，GRα的核定位相应增加，对激素敏感性随之升高［15］。在致炎因子的诱导下，多种炎性细胞及支气管上皮细胞的GRβ表达水平升高，但大多数炎性细胞GRβ的表达水平远低于GRα，所以有学者认为GRβ增加导致激素抵抗这一机制可能性不大［16］。然而，支气管上皮细胞在致炎因子诱导下，GRβ表达水平显著高于GRα，因此推测GRβ介导的激素抵抗机制与支气管上皮细胞密切相关［17］。

2 转录因子过度活化

2.1 核因子 κB(nuclear transcription factor，NF-κB)NF-κB是一种由来自Rel/NF-κB家族的两种亚基形成的同源或异源二聚体复合物，具有多向调节作用，也是哮喘发病机制中最受关注的信号转导系统之一。临床试验证实，NF-κB蛋白在哮喘患者呼吸道中被过度活化［18］。NF-κB与激素是免疫反应的两个重要调节因子，激素为免疫反应的抑制子，而NF-κB为激活子，两者之间存在相互抑制作用。激素可干扰NF-κB诱导炎症基因转录的能力，下调细胞因子和炎性介质的表达，达到抗炎的目的;NF-κB可通过阻止GR与DNA-GRE的结合，抑制其抗炎因子的产生，导致激素抵抗，而激素治疗不敏感的哮喘患者NF-κB水平较激素治疗敏感的哮喘患者明显升高［19］。最近研究发现，哮喘患者感染鼻病毒后对激素激素治疗的敏感性下降，可能是通过激活NF-κB和JNK激酶通路引起激素抵抗［20］。

2.2 活化蛋白1 活化蛋白1是细胞内的一个转录激活因子，是由c-Fos和c-Jun组成的异二聚体，属于亮氨酸拉链类转录因子;正常情况下活化蛋白1主要以c-Jun的形式出现，基本没有活性，但能够被各种炎性因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α、脂多糖、JNK等)激活，在基因表达层面在胞核内与DNA序列结合从而发挥生理活性［21］。JNK是MAPKs的一员，通过三级酶促级联反应磷酸化，活化的JNK由胞质移位至胞核，从而激活活化蛋白1等转录因子。活化的活化蛋白1参与哮喘重要炎性因子(如IL-5、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)基因的调控，是胞核内信号转导通路的交汇点，因而在哮喘的发病机制中发挥重要的作用。对难治性哮喘患者外周血细胞的研究发现，其活化蛋白1表达增加，活化的活化蛋白1在胞核与DNA序列结合，从而影响GR的核内结合水平，导致GRE活性降低，产生糖皮质激素抵抗现象［22］。试验表明，在难治性哮喘患者支气管活检样本集及肺泡灌洗液中，JNK高度激活活化，c-Fos明显增多，这部分患者在予以大剂量口服糖皮质激素治疗后，再次对其肺泡灌洗液检测，发现其中的JNK活性和c-Jun并无明显减少，这也正是重症哮喘继发糖皮质激素抵抗的机制之一;此外，c-Jun的增加能导致细胞骨架的解聚，影响结构细胞(上皮细胞、成纤维细胞、气道平滑肌细胞)中GR的生物活性［23-24］。

3 调节性T细胞的作用

调节性T细胞(Treg)是近年来发现的一种新型的具有免疫负性调节作用的T淋巴细胞亚群，能抑制过强的免疫反应，在维持外周免疫耐受、预防自身免疫性疾病，并且在抗感染免疫、肿瘤免疫、移植免疫、变态反应等许多病理性免疫过程中发挥重要作用［25］。目前对Treg研究中，其主要可分为CD4+CD25+T细胞、Tr1细胞、Th3细胞、γδT细胞，其中与免疫抑制关系较为密切的是CD4+CD25+T细胞。天然性CD4+CD25+T细胞起源于胸腺，占人外周CD4+T细胞5% ～10%，另外，还有一部由自体抗原刺激产生［26］。其功能主要是抑制自身及外来抗原的异常免疫反应，活化后分泌大量转化生长因子β和IL-10。IL-10是一种强大的抗炎因子和免疫抑制因子，通过抑制抗原呈呈递细胞发挥其免疫抑制功能，能够抑制哮喘患者Th2细胞的分泌。研究表明，IL-10的表达水平可用来评估哮喘病情，IL-10水平越高，其哮喘的患病率和严重程度越低，难治性哮喘患者IL-10水平较对糖皮质激素治疗敏感的哮喘患者明显著下降，提示IL-10可能与糖皮质激素的疗效相关［27］。哮喘患者CD4+CD25+T细胞数目减少，导致IL-10表达水平下调及导致免疫功能减弱或呈低反应性，这可能是引起支气管哮喘发病的机制之一［28］。

4 辅助性T细胞17

辅助性T细胞(telper T cells，Th)17是CD4+T辅助细胞亚群，其不同于传统的Th1和Th2细胞，主要分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、TNF-α 等促炎因子［29］。其中 IL-17A 不仅是Th17细胞分泌的一种促炎因子，同时还是Th细胞参与炎症反应的驱动因子，募集并促进其他促炎因子(如IL-6、TNF-α)的释放，增加黏液分泌和气道高反应性［30］。利用卵蛋白致敏小鼠形成哮喘模型表明，致敏后小鼠肺组织内的IL-17 RNA水平升高，同时出现中性粒细胞浸润，予以糖皮质激素干预后，IL-17水平显著下降，但中性粒细胞浸润现象无明显改善［31］。CD39是一种表达于白细胞的胞外核苷酸酶，可将损伤细胞、炎性细胞和激活T细胞释放到胞外的腺苷三磷酸依次分解为腺苷单磷酸和腺苷，以减轻组织炎性损伤，胞外腺苷三磷酸可上调IL-17表达和诱导Treg凋亡［32］。活性维生素D3通过增加CD39表达抑制IL-17的水平，从而不依赖于激素而发挥抗炎作用［33］。研究也证实，活性维生素D3可以独立于激素抗炎作用，抑制正常人和哮喘患者外周血单核细胞IL-17A的表达水平，其作用机制可能为:①维生素D3能增加CD39胞外核苷酸酶水平;②维生素D可下调GRβ的表达水平升高［34］。随着研究的进一步深入，维生素D3将在哮喘治疗领域发挥重要作用。

5 P糖蛋白的表达增多

P 糖蛋白属于腺苷三磷酸结合超家族转运蛋白一员，是一种相对分子质量为170 000的跨膜蛋白，在细胞膜上依赖腺苷三磷酸泵介导多种化学药物的流出通路，呈低水平、不均匀表达于正常组织以及造血干细胞、外周血单核细胞、成熟的巨噬细胞及T、B淋巴细胞等［35］。跨膜转运蛋白介导的细胞内药物排出增加，导致细胞内药物降低，是多重药耐药的重要机制。P糖蛋白是迄今为止研究的最多也是最重要的多重药耐药相关的蛋白，在溃疡性结肠炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、类风湿关节炎等炎性疾病的研究发现，需用激素的患者激素耐药与其外周血单核细胞的P糖蛋白170表达增高存在明显相关［36-39］。哮喘的治疗中，P糖蛋白对吸入糖皮质激素与全身使用糖皮质激素的作用不同，吸入糖皮质激素可以不通过P糖蛋白发挥其生物活性，并且吸入糖皮质激素后能诱导P糖蛋白的高表达，从而影响全身使用糖皮质激素的敏感性［40］。P糖蛋白在哮喘方面的研究目前还不深入，但可以肯定的是高水平的P糖蛋白是激素治疗不敏感的推动力。

6 巨噬细胞游走抑制因子

巨噬细胞游走抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)作为一种多功能细胞因子，参与细胞增殖、细胞迁移等多种病理生理反应。MIF是迄今为止唯一被认为能负向调节激素抗炎作用的细胞因子，亦可能是激素不能有效发挥抗炎作用的关键因子［41］。目前认为，MIF抵抗激素抗炎作用机制可能与拮抗3个关键蛋白及其相关的细胞信号通路有关，①丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(kinasephosphatase-1，MPK-1):激素通过诱导MPK-1基因表达及减少MPK-1蛋白降解使MPK-1合成增加，反馈抑制p38MAKP通路的激活，进而抑制信号通路下游的炎性蛋白分泌达到抗炎作用;②IκB激酶:是NF-κB信号转导通路的关键因子之一，通过解除IκB对NF-κB的抑制作用，从而激活免疫应答的各个环节，而糖皮质激素的抗炎机制之一正是通过促进IκB在胞核中的转录，而抑制炎性介质的释放，MIF通过对IκB激酶表达的上调，对抗激素在NF-κB/IκB信号转导通路中的效应;③膜联蛋白:在糖皮质激素诱导下产生抗炎作用的功能蛋白之一，作为MPK-1/IκBα信号通路中的上游蛋白［42］。动物实验表明，MIF缺失的哮喘小鼠气道高反应性、组织嗜酸粒细胞和黏液上皮化生差异无统计学意义，但是MIF与气道重构密切相关［43-44］。相信随着研究的深入，MIF抗体将作为治疗糖皮质激素不敏感哮喘的新手段。

7 小结

难治性哮喘糖皮质激素抵抗的发病机制涉及众多因素，而这些因素之间又存在或多或少的联系，互相影响。尽管近年来的研究取得一些进展(如p38MAKP抑制剂、JNK抑制剂、活性维生素D3、MIF单克隆抗体的研发及临床应用)，但糖皮质激素抵抗机制尚未完全阐明。探明糖皮质激素抵抗的分子机制对于深化难治性哮喘发病机制的认识，寻找新的治疗靶点，制订个体化的治疗方案具有重要意义。

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