登革病毒的实验室检测研究进展

李　娜(综述)，杨恒林(审校)

(1.大理学院病原与媒介生物研究所，云南 大理 671003； 2.云南省寄生虫病防治所/云南疟疾研究中心，云南 普洱 665000)

登革病毒的实验室检测研究进展

李娜1△(综述)，杨恒林1,2※(审校)

(1.大理学院病原与媒介生物研究所，云南 大理 671003； 2.云南省寄生虫病防治所/云南疟疾研究中心，云南 普洱 665000)

登革热是登革病毒引起的急性虫媒传染病。感染轻者无临床症状，是一种重要的传染源；重者表现为登革出血热，登革休克综合征甚至“重症登革热”等病死率较高的临床类型[1-3]。近些年，登革热的流行呈上升趋势，已经波及到热带、亚热带的100多个国家和地区[4]。在东南亚、太平洋和美洲，每年约有5000万登革感染者和50万患者因登革出血热而需住院治疗[5]。据报道，2012年泰国共出现7.4万登革病例，其中79例死亡[6]。我国从1980年后，登革热几乎每年都会在广东、广西、海南及福建等地发生不同程度的流行[3,7]。

1登革病毒结构

登革病毒属于黄病毒科黄病毒属，完整的登革病毒颗粒呈球形、近似二十面体立体对称，有包膜。登革病毒基因组为单股正链RNA，长度约10.6 kb[8]，分5′端非编码区、结构蛋白编码区、非结构蛋白(Non-structural,NS)编码区和3′端非编码区4个部分。3个结构蛋白是衣壳蛋白、膜蛋白及其前体和包膜蛋白；7个NS分别为NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5[8-9]。包膜蛋白大部分位于包膜的外表面，形成多个小突起，是登革病毒最主要的结构蛋白。作为一种抗原，它主要负责吸附和进入细胞，诱导宿主产生保护性中和抗体。病毒学家们根据包膜蛋白的不同抗原性利用血清中和试验将登革病毒分为4种血清型[10]。包膜蛋白的相对分子质量约为55 000，有3个不同区域的糖蛋白。利用X射线晶体学，在登革病毒2型和3型上存有这些区域，而域Ⅱ是非常重要的，因为它含有大量的黄病毒组和子组交叉反应的抗原决定簇[8]。病毒的衣壳蛋白具有特异的抗原决定簇，一般不诱导机体产生中和性抗体，为补体结合性抗原；前体蛋白是膜蛋白的前体，在病毒成熟过程中经特异性酶切后形成膜蛋白，它能使病毒感染增强，并形成病毒的表面结构。NS的作用至今尚不清楚[11]。

2发病机制

登革病毒感染人体后，在单核-巨噬细胞内进行复制,最终进入血液[8]。疾病的严重程度似乎与病毒感染这些细胞的能力有关。一种血清型的登革病毒感染机体后，刺激机体产生中和性抗体，使机体对该型登革病毒获得免疫力，但增强了被异型登革病毒感染的能力[2]。也有学者认为，该抗体对机体感染异型病毒有部分或短暂的保护作用[12]。隐性感染者或患者被伊蚊叮咬后，病毒在伊蚊的唾液腺及神经细胞中大量复制而获得感染力[13-14]。有文献指出,登革病毒还可通过母婴垂直传播和输血传播[15]。

对于发病机制近些年存在几种假说。较为流行的“二次感染学说”认为当人体初次感染某一型的登革病毒后，人体对同型的病毒可产生免疫力并可维持1～4年[16]。在免疫力还存在的情况下，患者再次感染登革异型病毒时，病毒在血液中与原有抗体结合，形成免疫复合物，引起组织免疫损伤，临床表现为出血或休克。Rosen[17]认为,登革出血热和登革休克综合征的发生是受一种毒力更强的登革病毒感染。目前普遍认为登革病毒3型的毒力最强，2型和4型次之，1型最弱。病毒通过变异产生毒力更强的病毒株，但这种假说并不能阐明登革出血热和登革休克综合征的发病机制[18]。

3实验室诊断

3.1血清学检测方法传统的血清学检测方法包括血凝抑制试验、补体结合试验和中和试验，目前也有许多针对于抗原抗体检测的技术方法。

血凝抑制试验敏感性高、重复性好、操作简便,曾被认为是登革病毒血清学检测的金标准。但它有诸多缺点：需预处理待检血清、准确的血凝抑制试验需要双份血清样本且双样本的滴度相差至少4倍方可确认为近期感染、易发生交叉反应，所以它逐渐被IgM、IgG抗体测定法取代[19-20]。补体结合试验是一种古老的方法，复杂费时、敏感性和特异性差，现已少用[19]。中和试验可进行病毒的鉴定，是登革病毒血清学诊断上最特异、最敏感的方法，但它只能对初次感染者进行型别鉴定，而且成本高、耗时长、对实验者技术要求高，操作繁琐，通常不用做诊断[21-22]。

NS1抗原是感染登革病毒的标志性抗原，它可早于IgM抗体出现[23]，在感染病毒以后，从发热的第1日开始，人体内会出现NS1抗原，可维持9 d，该抗原对早期诊断有重要意义。目前国外已有商品化的试剂盒用于登革病毒NS1抗原的检测。我国也研发了一些该类检测试剂，但还没有对这些检测试剂进行过全面、客观的临床评价，对其敏感性、特异性了解甚少，所以这些检测试剂还未获得国家有关部门的注册登记，无法用于登革热临床检测。IgM和IgG抗体捕捉酶联免疫吸附试验是最广泛的登革病毒感染的血清学方法,但是它测试的结果还需要第二份恢复期的血清进行确认。而且, 此方法在抗体滴度没有明显上升的发热期间没有作用[24-25]；此外，与其他密切相关的虫媒病毒存在交叉反应也是一个常见的问题。但是间接检测登革病毒IgM抗体的酶联免疫吸附试验是一种灵敏、特异、快速的定性检测方法，可作为临床登革热诊断的辅助措施。

3.2登革病毒的分离培养确诊登革病毒感染的实验室诊断是基于病毒特异性抗体的检测以及病毒的分离培养，但这些方法在早期诊断、敏感性以及快速性都不够理想。蚊培养细胞等培养分离出登革病毒曾被认为是确诊登革病毒感染的金标准，此方法不但能确诊是登革病毒感染，而且能鉴别出不同的血清型[26-29]。登革热的病毒血症期通常在发热2～5 d内，因此分离病毒应在发病后的4～5 d进行，耗时长，一般需要5～10 d[23,30-31],这样达不到快速早期诊断的目的。又因为对标本的储存和运输要求严格，需要专业的人员和设备，因此很难在普通实验室进行。其灵敏度仅为40.5%。为提高灵敏度和缩短鉴定时间，目前实践中该方法正逐步被反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)等快速诊断方法所代替[23，26]。

3.3分子生物学技术分子技术检测病毒基因组RNA序列正逐步被接受为检测登革病毒的新标准，主要通过RT-PCR和实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)对急性期患者的血清进行检测。PCR方法敏感性、特异性和重复性较高，且快速简便[22]，在登革病毒感染早期，可以用这种方法对登革病毒进行检测以及鉴定病毒型别,对分析登革病毒的传播、变异有重要的意义。与常规PCR相比，qRT-PCR更适用于登革病毒的实验室快速早期诊断，在发病第2日即可检测出登革病毒核酸。熊建英等[32]利用qRT-PCR和常规PCR对临床标本进行检测，结果表明qRT-PCR比常规PCR方法更加灵敏，耗时更短。但是,昂贵的核酸扩增仪和高水平的技能，限制了这些方法在资源有限的农村医疗机构中的应用。

Teoh等[24]发展和改进了环介导的等温扩增对登革病毒的检测方法，此方法对扩增的基因组序列敏感性高、不需要专门的设备，只需要一个能保持在60～65 ℃的恒温装置，被认为是各种传染性病原体包括登革病毒的检测方法。Carter等[33]研究了利用纳米技术检测登革病毒基因组RNA的方法:使脱氧核酶和纳米金粒耦合，当遇到登革病毒时，纳米金粒就快速的聚集形成一个由红色逐渐变为无色的反应混合物，从而检测出登革病毒。这为早期检测提供了一个低成本、快速可行的实验室诊断方法。由于脱氧核酶被设计为能识别所有的登革病毒的5′端环化序列，所以此方法不能对登革病毒进行分型。

4小结

全球登革热流行日趋严重，登革病毒的基因多样性也在增加，人类将长期受到更多样的致病性登革病毒的攻击。这为登革热快速诊断试剂提出更高的要求。目前的研究成果远远不能满足对登革热检测的需要。特别是我国目前还没有通过国家注册的登革热诊断试剂，这制约了登革患者的早期发现和及时隔离治疗，导致由于传染源积累而引起的暴发流行。为改变这种被动局面，我国急需对国产和进口的快速诊断进行临床评价，为获得国家注册提供科学依据，以使那些敏感性、特异性好、价格低廉的试剂尽快得到注册。

参考文献

[1] 王金章,严延生.登革热的研究现状[J].海峡预防医学杂志,2013,19(2):19-21.

[2]Lanciotti RS,Calisher CH,Gubler DJ,etal.Rapid detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction[J].J Clin Microbiol,1992,30(3):545-551.

[3]张复春.登革热的流行特点及治疗[J].医学与哲学,2010,31(18):21-23.

[4]张顺先,王英,闫磊,等.我国2005～2012年登革热流行特征分析[J].中国医药指南,2013,11(16):401-402.

[5]Guzman MG,Halstead SB,Artsob H,etal.Dengue:a continuing global threat[J].Nat Rev Micro,2010，8(12):S7-16.

[6]新华网.泰国今年登革热形势严峻，已致死59人[EB/OL]. (2013-07-03)[2014-04-01].http://www.yipd.org/Article/wPages/57c4099b-64130703145925.

[7]蒙中秋.2005年全球登革热/登革出血热的流行态势及我国口岸监测管理[J].中国热带医学,2005,5(7):1463-1468.

[8]Murrell S,Wu SC,Butler M.Review of dengue virus and the development of a vaccine[J].Biotechnol Adv,2011,29(2):239-247.

[9]廖德芳.登革病毒及其所致疾病的研究概况[J].云南畜牧兽医,2005(3):14-15.

[10]张守平,汪明.登革热研究进展[J].中国兽医杂志,2012,48(10):61-63.

[11]吴冰珊,严延生.登革热发病机制的研究进展[J].海峡预防医学杂志,2009,15(4):22-24.

[12]侯旭红,姜庆五,王建华.登革热的流行特征及防治措施[J].上海预防医学杂志,2005,17(8):379-380.

[13]卫生部疾病预防控制局.登革热预防手册[M].2版.北京：人民卫生出版社，2007：1-4.

[14]邵柏,张岳林,孙立伟,等.登革热在全球流行近况[J].中国国境卫生检疫杂志,1998,21(6):375.

[15]邓掌,张海林.全球登革热和登革出血热流行状况及防治研究进展[J].中国热带医学,2009,9(12):2318-2321.

[16]曾祥洁,金玉明,李丹丹,等.海南省2007年登革热血清学监测调查[J].中国热带医学,2008,8(10):1833-1834.

[17]Rosen L.The Emperor′s New Clothes revisited,or reflections on the pathogenesis of dengue hemorrhagic fever[J].Am J Trop Med Hyg,1977,26(3):337-343.

[18]黄俊琪.登革热发病机制的研究进展[J].实用医学杂志,2011,27(9):3464-3465.

[19]向浩,聂绍发.登革热实验诊断技术进展[J].临床检验杂志,2006,24(2):156-157.

[20]吴中华,罗鹏,徐琦,等.登革病毒检测技术研究进展[J].生物技术通讯,2013,24(5):727-731.

[21]贡树基,赵卫,曹虹.登革病毒感染实验室诊断的研究进展[J].中国人兽共患病杂志,2005,21(12):1103-1105.

[22]王艳红,宝福凯,柳爱华.登革病毒感染的检测技术研究进展[J].生命科学研究,2013,17(1):78-85.

[23]赵慧,秦成峰.登革热的实验室诊断[J].实用医学杂志,2011,27(19):3466-3468.

[24]Teoh BT,Sam SS,Tan KK,etal.Detection of dengue viruses using reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification[J].BMC Infect Dis,2013,13(1):387.

[25]何金林.登革热病毒感染标志物检测进展[J].中国媒介生物学及控制杂志,2011,22(5):509-511.

[26]郭鹏娟,甘标,詹希美.登革热实验室诊断研究进展[J].中国公共卫生管理,2013,29(5):567-570.

[27]韩万柏,杨学颖.我国登革热研究概况[J].临床军医杂志,2003,31(3):103-104.

[28]鲍晓伟,黄勇,李艺江,等.登革热病毒的实验室诊断研究进展[J].中国卫生检验杂志,2008,18(11):2436-2438.

[29]杜福.登革热病毒分离及血清学检查方法[J].广东卫生防疫资料,1980(2):25-33.

[30]肖杰生.登革热研究的热点问题[J].新医学,2002,33(3):133-135.

[31]张志珊,严延生.登革热实验室诊断和疫苗的研究进展[J].中国人兽共患病学报,2006,22(5):460-463.

[32]熊建英,张复春,马丹娟,等.登革 1型病毒荧光定量 PCR 快速检测[J].中国公共卫生,2012,28(1):69-71.

[33]Carter J,Balaraman V,Kucharski C,etal.A novel dengue virus detection method that couples DNAzyme and gold nanoparticle approaches[J].Virol J,2013,10(1):201.

肿瘤医学

摘要：登革热是由登革病毒引起的，主要通过媒介伊蚊叮咬而传播的急性传染病。登革热主要流行于热带、亚热带等适于伊蚊生长繁殖的国家和地区。近年来，登革病毒流行范围愈加扩大，严重危害人类的生命与健康。目前全球缺乏特效抗登革病毒药物和理想的登革病毒疫苗,我国迄今没有国家注册的诊断(检测)试剂。加强传播媒介监控,及时发现、隔离与治疗患者是防止登革热暴发流行，减少重症患者和死亡的主要措施。作为及时发现、确诊登革热患者的主要方法，快速准确的检测是登革病毒实验室检测技术的主要研究方向。

关键词：登革热;登革病毒;实验室检测

Research Progress of Laboratory Detection of Dengue VirusLINa1,YANGHeng-lin1,2. (1.InstituteofPathogensandVectorsofDaliUniversity,Dali671003,China; 2.YunnanInstituteofParasiticDiseases/MalariaResearchCenterofYunnanProvince,Pu′er665000,China)

Abstract:Dengue fever is an acute infectious disease caused by dengue virus and transmitted by aedeses.Dengue fever is mainly epidemic in tropical and subtropical countries or regions which are suitable for the growth and reproduction of aedeses.The epidemic area of dengue virus is extending in recent years,gravely threatening the human life and health. So far there are still no dedicated antiviral drugs and ideal vaccines to dengue virus globally and no national registered diagnostic reagents in China. The main measures to prevent prevalence and outbreak of dengue fever and to reduce the number of severe patients and death are to strengthen the monitoring and control of dengue media,isolate and treat the patients. As a primary measure to discover and confirm dengue patients,rapid and accurate detection is the main direction of research on the laboratory detection of dengue virus.

Key words:Dengue fever; Dengue virus; Laboratory detection

收稿日期：2012-07-21修回日期：2014-10-29编辑：相丹峰

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.06.014

中图分类号：R373.33

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)06-0997-03