刺猬信号通路在氟中毒软骨损害机制中的研究进展

朱志坚，陶　欣(综述)，于燕妮(审校)

(贵阳医学院病理学教研室，贵阳 550004)



刺猬信号通路在氟中毒软骨损害机制中的研究进展

朱志坚△，陶欣△(综述)，于燕妮※(审校)

(贵阳医学院病理学教研室，贵阳 550004)

摘要：氟在生理代谢过程中发挥着不可替代的作用，适量的氟能促进神经系统及运动系统的生长发育，但摄入过多将会引起一系列的中毒症状。氟骨症是一种慢性骨关节病，其主要侵害四肢关节的软骨、骨及骨周组织。刺猬(Hh)信号通路是一条经典的胚胎发育和分化信号转导系统，在胚胎发育和细胞分化增殖中起重要作用，且Hh信号通路中的许多因子直接对软骨及骨的发育起调控作用。因此，Hh信号通路可能参与氟中毒软骨损害的发病机制。

关键词：地方性氟中毒；Hh信号通路；软骨损害

地方性氟中毒是指长期生活在高氟地区的居民通过饮水、食物和空气等方式，使机体摄入过量的氟而导致的一种慢性全身性疾病；主要临床改变分为骨相损害和非骨相损害，轻度氟骨症只有患病关节疼痛的症状，而重度却可导致关节畸形，甚至造成肢体残废。目前，地氟病的发病机制仍在研究中，近年来有大量学者通过各种信号通路来研究地氟病的发病[1-2]。刺猬(hedgehog，Hh)信号通路基因是一种分节极性基因，是Nusslein-Volhard和Wieschaus[3]在研究果蝇发育时发现的。正常情况下该通路对机体的生命活动起重要调节作用[4-5]。外界刺激引起Hh信号通路的异常激活，参与了多种疾病的发生、发展[6-7]。现就Hh信号通路在氟中毒软骨损害中的可能机制进行综述。

1Hh信号通路的主要成分、生物学特性及功能

Hh信号通路由Hh蛋白、靶细胞膜上两种蛋白受体[修补蛋白受体(patched，Ptc)和七次跨膜蛋白受体(smoothened，Smo)]及三种锌指转录因子Gli1、Gli2、Gli3组成[8]。在果蝇和其他无脊椎动物中只有1种Hh基因，而在哺乳动物中存在3种同源基因，即音速刺猬因子(sonic hedgehog，Shh)、印度刺猬因子(indian hedgehog，Ihh)及沙漠刺猬因子(desert hedgehog，Dhh)，编码Shh、Ihh和Dhh蛋白。这三类蛋白均由N末端结构域和C端结构域构成，在N端结构域端存在Hh蛋白的活性信号，而C端结构域端则具有自身蛋白水解酶活性和胆固醇酰基转移酶功能。在一定条件下，这3种Hh蛋白可相互代替，但它们均具有自己独特的生理功能：Shh作为细胞内信号分子，在Hh信号转导过程中起主导作用，决定早期肢体的前后生长及体部左右对称模式；Ihh在软骨及成骨细胞的分化过程中起调节作用；Dhh在外周神经系统的发育及生殖细胞的产生迁移中起调控作用[9]。Shh、Ihh和Dhh蛋白均为Hh前体蛋白，本身不具有信号转导活性，只有经过棕榈酰化后才能获得活性。Hh信号通路的传递受靶细胞膜上Ptc和Smo两种蛋白受体控制，Ptc蛋白由肿瘤抑制基因Patched编码，由12个跨膜区的单链构成，能与配体直接结合，在哺乳动物中存在Ptch1和Ptch2两种基因，Ptch1基因可对Hh信号起负调控作用，而Ptch2基因的转录可以不依赖于Hh信号通路[10]；Smo蛋白由原癌基因Smothened编码，由7个跨膜区的单链构成，其N端位于细胞外，C端位于细胞内，该蛋白只有当维持全长时才具有启动下游靶基因的功能，当被蛋白酶水解时，该蛋白可形成转录抑制子，抑制下游因子转录[11]。Hh信号通路转导的核心部位是含锌指结构，包括Gli1、Gli2和Gli3三个成员，其中，Gli1具有转录激活作用，且激活后的Gli1可通过正反馈加强Gli1的活化[12]；Gli2、Gli3蛋白均存在两个功能区域，即C端的激活区域和N端的抑制区域，此两区域的功能复杂，可在不同的环境中对Hh起激活或抑制作用[13]。研究发现，Smo是Hh信号传递所必需的受体，当Hh蛋白缺乏时，Smo蛋白与Ptc结合，从而抑制Smo的活性，使下游Gli蛋白在蛋白激酶A的作用下发生磷酸化，并在蛋白酶体内将Gli蛋白截剪成小片段，使Gli以小片段的形式进入细胞核内，从而抑制下游目的基因的转录；当Hh蛋白存在时，Ptc与Hh结合，从而解除对Smo的抑制作用，促使Gli蛋白复合物与微管形成，使得Gli蛋白以全长形式进入核内，进而激活下游目的基因转录[12]。下游靶基因包括纤维生长因子、骨形成蛋白、胰岛素样生长因子2、抗凋亡蛋白Bcl-2、细胞周期蛋白D1及Hh相互作用蛋白等[14]。研究发现，Hh信号通路能被一些小分子物质(如：5E1、环杷明、GDC-0449等)特异性地抑制，这些小分子物质可通过阻断Hh与Ptch和(或)Smo的结合，从而阻断Hh信号通路的转导[14,16]。

2Hh对软骨细胞的作用

Hh信号对软骨细胞的生长发育起重要调节作用。研究发现，去除Smo因子的软骨细胞增殖速度明显降低，相反，上调Smo的表达则可促进软骨细胞增殖[16]。Shh对软骨细胞的功能意见不一，有学者认为Shh不仅能促进软骨间充质细胞和前软骨细胞向软骨细胞分化，也能抑制体外培养的软骨细胞肥大成熟[17]；但也有学者发现，在软骨细胞生长的早期阶段Shh表达量低，而到了软骨细胞成熟阶段Shh表达却增加，因此认为Shh具有促进软骨细胞成熟肥大的功能[18]。还有学者发现，在软骨分化晚期可由骨形成蛋白进行特异性调节[19]。在膝关节骨关节炎的患者中，Ihh蛋白及信使RNA的表达量较正常组高，且随着软骨破坏度加重，Ihh蛋白及信使RNA的表达量进一步增加[20]。在膝关节炎大鼠模型中，Gli1、Ptch、Hh相互作用蛋白的表达量增加，而当Smo基因被沉默或使用Hh特异性抑制剂处理时，膝关节骨关节炎的严重程度减轻[21]。张杰等[22]的研究证明，渐进性咬合紊乱促进了大鼠髁突软骨中Ihh及其受体Smo的高表达，而对Ptchl的表达差异无统计学意义。Campbell等[23]研究发现，在软骨肉瘤中Smo蛋白高表达，而使用Smo抑制剂(PI-926)降低Smo蛋白表达可明显抑制肉瘤的增长。这些研究成果均表明Hh信号通路不仅可调节软骨细胞的生长、发育，还可参与软骨病变的发生、发展。

3Hh信号通路在氟中毒软骨损伤中的可能机制

3.1氟对软骨细胞的影响研究发现，氟是参与胶原代谢密切的微量元素，机体摄入过量的氟能导致胶原代谢异常，而胶原蛋白是软骨组织重要的成分之一，因此氟中毒时可影响软骨代谢[24-26]。在低剂量氟时，可发现双核的软骨细胞数量增多，细胞内线粒体内质网肥大，这些改变使软骨细胞的代谢功能增强，以促进细胞的增殖；而在高剂量氟时，却可引起软骨细胞核固缩凝聚成块状聚集在核膜周边，线粒体内质网电子致密物下降，使其发生退行性变和髓样变，并有凋亡细胞的出现[27]。氟不仅可引起软骨细胞细微结构的改变，还可引起软骨组织的病理损害，表现为骺和关节软骨深层的肥大软骨细胞数量增多，预备钙化层不能钙化；增厚的骺板软骨细胞柱排列不整，干骺端血管侵入受阻，使关节软骨细胞缺血坏死[28]。有研究者发现，小鼠饮用含高浓度氟化钠的自来水后，软骨基质内出现大小不均、方向不一的圆形或椭圆形裂隙，软骨细胞层次排列不清，细胞数量减少，软骨层变薄，骨小梁增宽，并可出现软骨细胞的部分坏死，提示氟中毒时软骨可出现不同程度的骨化，具有硬化性氟骨症的病理改变[29]。目前，大多数学者认为氟诱导的氧自由基学说及细胞凋亡学说是研究氟中毒发病机制的经典学说。

3.2Hh信号通路与氟中毒氧自由基水平升高对软骨的影响在正常情况下，活性氧自由基可由细胞代谢不断产生与清除，两者处于动态平衡状态。当活性氧自由基产生超过机体防御体系的清除能力或机体的防御体系不能正常发挥功能时，体内氧自由基代谢就会出现失衡，即氧化应激。氟是一种化学性质极为活泼的元素，具有较强诱导脂质过氧化的能力。氟中毒时，氟离子与抗氧化酶的活化中心结合，使抗氧化酶(如谷胱甘肽S转移酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等)活性下降，而活性氧自由基及脂质过氧化物等指标水平升高，导致机体氧化与抗氧化失衡，造成细胞损伤[30]。研究发现，用不同浓度的氟处理体外培养的软骨细胞后，在培养基中过氧化氢及一氧化氮水平随氟浓度的增加而增加，而使用超氧化物歧化酶处理后，培养基中的氧自由基水平降低，表明氟可促进软骨细胞氧自由基的产生，而超氧化物歧化酶可减少或抑制氧自由基的产生[31]。并且，在氧自由基作用下，软骨细胞柱出现长度增加及横径变短等病理改变，说明氟引起软骨细胞损害与氧化应激反应有关；软骨细胞在氧自由基作用下还可使其分泌的Ⅱ型胶原转变为Ⅰ型胶原，导致软骨细胞分化的异常[32]。研究表明，Hh信号通路与氧化应激有着密切的联系，机体发生氧化应激损伤时可刺激Shh的释放；同时，氧化应激与Shh可发挥协同作用，共同调节谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛、Bcl-2和超氧化物歧化酶等的表达；且激活的Shh还可抑制Bax的表达，而促进Bcl-2的表达[33-34]。但也有研究发现，在体外培养的乳鼠心肌细胞给予氧化应激系统刺激后，Shh蛋白及信使RNA的表达下降，当使用维生素C和维生素E处理后，Shh蛋白及信使RNA的表达出现逆转，提示了氧化应激会引起Shh表达下降；研究还发现，氧化应激诱导机体分泌的Shh可利用Hh信号通路对星形细胞起到保护作用[35]。此结果均提示Hh信号通路可能参与氧自由基对软骨细胞损害作用。

3.3Hh信号通路与氟中毒凋亡对软骨的影响细胞凋亡是一种基因调控的程序性细胞死亡方式，具有特征性形态和生化改变。凋亡的发生受到多种基因严格控制，包括胱天蛋白酶(caspase)家族、Bcl-2家族、癌基因(如c-myc、p53)和抑癌基因等。当氟中毒时，过量氟引起自由基升高可直接作用于核酸，引起碱基修饰甚至DNA链的断裂，进而引起聚腺苷二磷酸核酸转移酶的活化和p53的积累，引起细胞凋亡；同时，氟造成细胞膜通透的改变使细胞质中钙离子浓度增高，使钙依赖caspase活性升高，进而破坏细胞骨架，使细胞发生凋亡；并且，过量氟化物刺激体内一氧化氮合酶的表达，造成一氧化氮产生过量，过量的一氧化氮激活促凋亡因子Bax，Bax引起线粒体释放细胞色素C，而释放的细胞色素C又可与凋亡蛋白激活子1结合，进而激活启动型caspase(caspase-9)及执行型caspase(caspase-3)，而caspase-3通过剪切蛋白后可进入细胞核降解DNA链，导致细胞凋亡[36]。研究表明，许多参与细胞增殖、凋亡的效应分子(如细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、细胞周期蛋白B、Bcl-2、c-myc)被证明是Hh信号通路的下游分子[37]，因此Hh信号通路可利用这些分子对细胞的增殖及凋亡发挥调控作用。有报道，Gli3水解后可抑制Bcl-2启动子，促进凋亡[38]；但也有研究发现，Bcl-2的顺式调控区存在3个Gli2的结合位点，这些位点可被Gli2识别，进而选择性地激活人类Bcl-2的启动子，促进Bcl-2的表达，以抑制细胞凋亡[39]。研究者通过RNA干扰技术对人食管癌细胞Smo因子沉默后，发现细胞的凋亡率明显升高，此外还发现Shh可通过激活磷脂酰肌醇3-激酶信号和稳定Bcl-2、Bcl-xL来保护胰腺导管细胞免受凋亡[40]。此结果均提示Hh信号通路对细胞的凋亡可起调控作用。

此外，Hh信号通路与Wnt、Ras、丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶等信号通路发生交联，使Hh通路的调节和作用复杂化[41]，而这些信号通路均被证明参与了氟中毒的发病机制[42-43]。Hh信号通路与这些信号通路、细胞凋亡以及氧化应激之间的联系密切，可能共同参与了地方性氟中毒软骨损害的发病机制。

4小结

氟中毒时对软骨细胞有严重的损害作用，可引起软骨细胞的凋亡、坏死及分化异常，造成软骨层变薄、软骨骨化等病理改变，而软骨损害是导致关节活动障碍、影响患者日常生活的主要原因。氟骨症的发生可能与过量氟造成机体氧自由基、一氧化氮水平升高及过度激活信号通路有关。通过对氟中毒发病机制的深入探讨，将对预防氟中毒的发生、发展及提高患者的生存质量起到极其重要的作用。

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Research the Mechanism of Hedgehog Signaling Pathway in Chondrocyte Damage in Endemic FluorosisZHUZhi-jian,TAOXin,YUYan-ni.(DepartmentofPathology,GuiyangMedicalCollege,Guiyang550004,China)

Abstract：Fluorine plays an irreplaceable role in the process of physiological metabolism:appropriate amount of fluoride can promote development of the nervous system and motor system,but excessive intake will cause a series of poisoning symptoms. Skeletal fluorosis is a kind of chronic joint disease,which mainly damages the limb joint cartilage,bone and bone tissues. Hedgehog(Hh) signal pathway is a classic signal pathway of embryonic development and differentiation,which plays an important role in cell differentiation and proliferation during the embryonic development.And many factors of the Hh signaling pathway have direct regulatory role on the growth of cartilage and bone.Therefore, the Hh signaling pathway may be involved in the pathogenesis of cartilage damage in fluorosis.

Key words：Endemic fluorosis； Hh signal pathway； Chondrocyte damage

收稿日期：2015-06-04修回日期：2015-06-30编辑：郑雪

基金项目：国家自然科学基金(81260419)；教育部博士点基金(博导类)(20125215110001)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.011

中图分类号：R363.1

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)18-3294-03