缺血/再灌注时心肌保护通路的研究进展

屈园园(综述)，余锂镭，江　洪(审校)

(武汉大学人民医院心内科，武汉 430060)



缺血/再灌注时心肌保护通路的研究进展

屈园园△(综述)，余锂镭，江洪※(审校)

(武汉大学人民医院心内科，武汉 430060)

摘要：近年来，我国急性心肌梗死发病率明显上升，已接近国际平均水平。心肌缺血/再灌注损伤(I/RI)是缺血心肌恢复血运后的常见并发症。研究表明，I/RI与线粒体功能结构损害关系密切。心肌发生缺血/再灌注时，心肌细胞发生一系列病理生理变化。迄今为止,已发现多种手段可用来减弱I/RI，该保护通路包括乙酰胆碱、一氧化氮合酶、一氧化氮、内皮细胞、蛋白激酶Cε、线粒体连接蛋白43、线粒体ATP敏感性钾离子通道。

关键词：缺血/再灌注损伤；心肌细胞；线粒体

发生心肌梗死时，及时手术或溶栓治疗能挽救部分心肌，降低心功能损伤程度。但在血流恢复的同时，伴随有缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury，I/RI)。缺血预处理(ischemic precondition，IPC)、缺血后处理、药物处理以及迷走神经刺激术均能发挥心肌保护作用，对抗I/RI。传统观念认为[1]，线粒体是真核细胞ATP生成的主要场所。新近研究发现[2]，缺血/再灌注时线粒体与心肌保护通路关系密切，是心肌细胞存活和心律失常发生的一个关键因素。对于该保护通路的研究越来愈多，但其保护机制尚未完全明了，现就该通路及其构成进行综述。

1乙酰胆碱

早期研究发现[3]，乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)是依赖于内皮细胞的血管扩张因子。缺血/再灌注发生后，心脏冠状动脉对Ach的扩张反应显著降低。而只对实验动物进行缺血处理，取下冠状动脉后发现，其对Ach的舒张反应并无变化[4]，证明心肌缺血后内皮功能受损是再灌注损伤的表现。

Ach通过一氧化氮(nitric oxide，NO)，选择性增加蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)酶活性，而对其他PKC异构体无任何影响[5]。缺血和再给氧可产生大量自由基，短暂给予Ach可显著减轻氧化应激反应，增加存活的心肌细胞。毒蕈碱受体对于氧自由基的产生至关重要，生成的这些氧自由基中，NO占到大部分，但同时也存在其他含氧产物，如H2O2[5]。

2一氧化氮合酶

NO可由3种一氧化氮合酶( nitric oxide synthase,NOS)异构体催化合成——诱导型NOS(inducible NOS，iNOS)、内皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)，神经型NOS(neuronal NOS，nNOS)。心肌细胞持续表达eNOS和nNOS，并通过亚细胞定位依赖性途径诱导出其生物学活性[6]。正常情况下，心肌细胞不表达iNOS，在某些应激条件下可表达，因此被认为对心脏有害。NOS催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸和NO，该过程需要还原型辅酶Ⅱ、黄素单核苷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、钙调蛋白、血红素和四氢生物嘌呤作为辅助因子参与。在缺血/再灌注发生时，NOS脱偶联，失去转换功能，无法将L-精氨酸转化为L-瓜氨酸，NOS将电子自还原型辅酶Ⅱ转移至1分子氧上，生成超氧化物(O2-)，而非NO。由于NOS脱偶联，超氧化物生成，导致心肌组织处于氧化应激状态，心功能因此受损。伴随氧化应激状态，由NOS生成而来的NO水平下降，生物利用度下降。研究表明[7]，糖尿病患者在缺血/再灌注时，iNOS是酶脱偶联的靶点，补充BH4，iNOS发生再偶联，保护心脏[8]。尽管尚未完全了解NOS脱偶联的原因，但BH4被超氧化物氧化，NOS磷酸化，NOS功能性二聚体遭到破坏在其中发挥重要作用。缺血/再灌注发生可引起NOS脱偶联，而NOS脱偶联可进一步促进再灌注后的损伤和心功能不全的发生，导致I/RI[9]。

NOS脱偶联最显著的诱因是：NOS的辅助因子BH4被氧化，或者二氢叶酸还原酶表达减少，最终导致BH4生成减少。三磷酸鸟苷通过多个步骤生成BH4，BH4还可以通过另一补救途径生成——回收的二氢叶酸还原酶将循环的氧化7，8-二氢生物蝶呤转化为BH4。氧化应激清除BH4，在NOS脱偶联中发挥主要作用。超氧化物可直接将BH4氧化为二氢生物蝶呤，NOS二聚体解体发生脱偶联。缺血/再灌注时，这是NOS脱偶联的主要原因，由于超氧化物增多，BH4/二氢生物蝶呤比例下降，NOS发生解偶联。氧化应激通过氧化作用，直接降低二氢叶酸还原酶表达，以此降低补救旁路的活性，影响BH4生物利用度[10]。

3NO

NO不仅是内皮细胞产生的松弛因子，还能影响心脏器质和功能。通过刺激可溶性鸟苷酸环化酶，引起环鸟苷酸水平增高，并激活蛋白激酶[11]。同时存在一条不依赖于cAMP的NO作用途径，NO将胱氨酸残基的游离巯基硝基化(S-亚硝基化)，这能改变酶活性，对心功能的改变至关重要[12]。NOS脱偶联导致了两种损伤：NO产量下降，过氧化物生成增多。NO除了具有抗氧化作用，还能抑制由还原型辅酶Ⅱ氧化酶催化的超氧化物产生，这种超氧化物是病理状态下O2-的主要来源[13]。NO可以成为细胞内氧化应激的调节器。NO可与超氧化物O2-反应生成过氧硝酸盐(ONOO-)。过氧硝酸盐本身对细胞有害，但与O2-相比危害较小，同时还能促进氧化应激。

NO还对心脏收缩功能产生影响，将该作用称为不依赖于可溶性鸟苷酸环化酶的S-亚硝基化激活。NO通过非酶促附着的S-亚硝基化来降低-SH的数量，产生翻译后化学修饰，引起相应的生物学功能[S-亚硝基化最重要的靶点(心脏)是电子链，尤其是心肌肌浆网Ca2+释放通道——兰尼碱2型受体][14]。心肌细胞中的nNOS位于肌质网上，敲除小鼠nNOS基因导致心脏射血分数下降，Ca2+分布瞬间改变[15]。兰尼碱2型受体无法被S-亚硝基化，随即Ca2+从细胞肌质网漏出(Ca2+漏出不会降低收缩能力，但容易诱发心律失常)。心肌细胞内eNOS可调控钙通道功能，eNOS位于L-型钙调蛋白通道上利于S-亚硝基化，能抑制Ca2+灌流[12]。脱偶联时，NO生成减少，O2-生成增加导致氧化应激，使心肌受损，心脏收缩功能降低。

4内皮细胞受损

缺血后阶段内皮功能障碍需要氧分子的参与，内皮细胞的I/RI源于活性氧类(reactive oxygen species，ROS)的生成。ROS清道夫可以减弱或阻止内皮细胞功能障碍的发生。动物实验表明[16]，再灌注所致的内皮细胞损伤是由氧自由基衍生物所致，在微循环内，给予超氧物歧化酶和过氧化氢酶，依赖于内皮细胞的舒张功能受损的情况可得到改善。

氧自由基引起内皮细胞损伤可由一些机制解释。超氧化阴离子(O2-)一旦生成，会钝化NO。而NO可抑制中性粒细胞的激活和黏附，所以NO产量降低可导致急性炎症反应的发生、发展。另外，再灌注时期生成的自由基也会通过诱导黏附分子(如选择蛋白或细胞间黏附分子1)激活中性粒细胞，使其迅速黏附于内皮细胞。NO产量降低，自由基生成增加，两者联合使中性粒细胞对内皮细胞的黏附作用增强，中性粒细胞对内皮细胞的损伤作用得到放大。考虑到NO还有扩张血管的重要属性，内皮细胞受损同时导致冠状动脉收缩增强，冠状动脉痉挛发生的风险增加。

5PKCε

近几年的研究较多关注PKCε在IPC中的作用，试图理解其机制。有证据显示，PKCε在IPC时转移至线粒体[17]，PKCε的肽催化剂(将PKCε传递至线粒体)使心肌具备抵抗I/RI的能力，表明心肌保护作用源于线粒体内PKCε的调控作用。IPC在线粒体中的信号转导体系中，数个转导信号均为PKCε的靶点，其中包括线粒体通透性转换孔。尽管ROS形成过多会对心肌细胞造成损害，但少量的ROS能诱发IPC的保护作用，激活PKCε。NO选择性激活PKCε异构体，PKCε激活后在细胞内转移，其效应与IPC相同。

6线粒体连接蛋白43

线粒体连接蛋白43(mitochondrial connexin 43，mCx43)存在于线粒体内膜上。已有实验证明[18]，IPC能增加线粒体上mtCx43的含量。体外实验中观察到，PKCε能将mCx43磷酸化，在心肌细胞保护作用的信号级联反应中，PKCε位于mCx43上游[19]。细胞保护性信号转导过程中，PKC及其下游的线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP-sensitive K+channel,mKATP)均位于肌膜下的线粒体，与上游的受体相邻。肌原纤维间的线粒体与这些细胞保护通路无关，这类线粒体上的mKATP对二氮平(mKATP开放剂)和PKC均不敏感[18]，说明不同的线粒体亚群有不同的亚细胞功能，只有肌膜下线粒体通过激活mKATP来达到保护心肌细胞的目的。

7mKATP

有研究显示，氧自由基衍生物产物通过激活mKATP通道和线粒体通透性转换孔，促发IPC信号转导通路。mKATP通道开放后，K+流入线粒体，使线粒体基质产生去极化以及碱化作用，IPC早期和晚期，基质的这些变化通过诱导ROS的下游产物，反过来激活细胞存活通路[19]。mKATP可在再灌注发生后降低ROS的产量，维持线粒体膜电位在较高水平，保护线粒体呼吸功能。在缺血缺氧情况下，呼吸链迅速减少。大量ROS生成，使呼吸链中的电子迅速漏出，氧化磷酸化脱偶联，因此ATP生成减少，呼吸链的膜磷脂和蛋白也受到损伤。在缺血缺氧条件下，ATP/ADP比率下降可激活mKATP。吡那地尔心停搏法降低了线粒体ROS的产量，而5-羟基葵酸盐(mKATP选择性阻滞剂)可部分阻断该作用，表明mKAPT通道开放可降低线粒体的氧化性损伤，维持能量供给[20]。mKATP开放对心肌具有保护作用，其机制可能为：减少ATP丧失，削弱氧化损伤，维持线粒体膜电位，抑制细胞内钙超载。

8结语

发生心肌梗死的患者越来愈多，随着介入手术和冠状动脉旁路移植术的普及，I/RI越来越受到人们的重视，对于心肌保护通路的研究多年来一直是学术界的热点。近年来国内外多项实验多倾向于从线粒体水平上研究亚细胞结构的改变和心肌细胞受损情况，并发现存在于细胞膜上转导动作电位的Cx43同时也存在于线粒体膜上。通过各种干预，在一系列细胞信号作用下，线粒体通透性转换孔和mKATP开合情况发生变化，最终导致线粒体受到不同程度的损伤。这些新的研究成果，为深入了解I/RI的发生机制及治疗手段提供理论依据。

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A Study of Myocardial Protective Pathway in Ischemia-ReperfusionQUYuan-yuan,YULi-lei,JIANGHong.(DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Abstract：The incidence of acute myocardial infarction has been ascending notably in recent years and is reaching international average.Myocardial ischemia/reperfusion injury(I/RI) is a common complication after recover of the blood supply in ischemic myocardium.Studies show that I/RI is closely associated with impairment of mitochondrial function and structure.Cardiomyocytes suffer from a series of pathophysiological changes when ischemia/reperfusion occurs in myocardial infarction.So far multiple measures have been discovered to attenuate I/RI.This protective pathway includes acetylcholine,nitrogen monoxide synthase,nitrogen monoxide,protein kinase Cε,mitochondrial connexin 43 and mitochondrial ATP sensitive potassium channel.

Key words：Ischemia/reperfusion injury; Myochardium; Mitochondria

收稿日期：2014-10-20修回日期：2015-02-27编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.007

中图分类号：R543.31

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)18-3283-03