mtSSBP1与相关性疾病的研究进展

龙　盘,常　淞(综述),黄小军(审校)

(第四军医大学 a.航空航天医学系，b.基础部教学实验中心，西安 710032)



mtSSBP1与相关性疾病的研究进展

龙盘a,常淞a(综述),黄小军b※(审校)

(第四军医大学 a.航空航天医学系，b.基础部教学实验中心，西安 710032)

摘要：线粒体单链DNA结合蛋白(mtSSBP1)是定位于线粒体基质和拟核的同源四聚体，在线粒体DNA的复制、转录以及损伤后修复等一系列生物学行为中发挥着重要作用。当mtSSBP1表达失调时，mtDNA发生基因突变，尤其是处于恶劣的环境条件下，如高氧化应激、水解脱氨基反应、烷基化作用，DNA损伤将大量积累，最终导致多种相关疾病的发生、发展。目前关于mtSSBP1的分子机制及其与疾病相关分子通路的研究正处于探索阶段，该文就近年来的研究进展予以综述。

关键词：线粒体单链DNA结合蛋白；结构；功能；肿瘤

线粒体是真核生物细胞内的重要细胞器，是新陈代谢和生物能量转换的重要场所，在生命活动中发挥着重要作用，同时也影响到细胞的衰老死亡，甚至导致肿瘤或其他人类线粒体遗传疾病。人类线粒体基因组是由16 569个碱基对组成的环状双链DNA，mtDNA 编码呼吸链中与氧化磷酸化过程相关的多个蛋白质，因此线粒体基因组的完整性对于生物体有重要意义。同时，线粒体又受到多种核基因产物的调控，目前在线粒体中发现多种DNA-蛋白质复合物参与线粒体的复制、转录和损伤后修复，如mtDNA聚合酶γ(mtDNA polymerase gamma,POLG)、线粒体单链DNA结合蛋白(mitochondria single-strand DNA protein 1，mtSSBP1)、线粒体DNA解旋酶(TWINKLE)、连接酶、拓扑异构酶、线粒体转录因子A，而mtSSBP1作为其中调节因子发挥着重要作用。现就mtSSBP1的功能和功能异常导致的相关疾病予以综述。

1mtSSBP1的介绍

mtSSBP1以往也称mtSSBP，是由148个氨基酸组成的同源四聚体结构，主要定位于线粒体基质和拟核。两个结构域分别是核酸结合区和PriB蛋白/单链DNA结合区[1]。人类mtSSBP1定位于第7号染色体长臂3区4带，由49 602个碱基对组成，由4个外显子和3个内含子组成，广泛分布于血液系统、神经系统、肌肉组织中。由于线粒体起源于单细胞生物与细菌的“内共生体”，mtSSBP1在进化上是保守的，它与原核生物和噬菌体的SSB蛋白属于同族[2]。在与原核生物的SSB的结构比较中发现，一些原核生物，如大肠埃希菌的SSB并没有C端结构域，说明在进化过程中mtSSBP1结构更趋完整，功能也更为复杂[3]。

2mtSSBP1的功能

与细胞核DNA复制方式类似，mtDNA也是半保留复制。在TWINKLE的作用下，双链环状mtDNA解链形成ssmtDNA、mtSSBP1和POLG、TWINKLE等蛋白因子互相作用，共同参与mtDNA的复制。研究发现，mtSSBP1通过特异性活化TWINKLE，可提高mtDNA前体的解链速度[4]。 体外实验发现[5]，mtSSBP1通过增加POLG的前体识别能力，提高了POLG的活性，同时，促进了在mtDNA链延长过程中POLG的持续合成。Oliveira和Kaguni[6]通过突变mtSSBP1的特定碱基得到5种变异的mtSSBP1，荧光素标记后观察mtSSBP1、POLG以及ssmtDNA之间相互作用的三维结构模型，发现mtSSBP1通过不同结构域与POLG和TWINKLE相互作用，一旦mtSSBP1形成变异体后将与POLG和TWINKLE的结合发生缺陷，导致mtDNA的复制受到抑制。Kaguni和Kaguni[3]为了探究mtSSBP1的C端和N端的作用，通过基因敲除获取了C端和N端缺失的mtSSBP1，发现缺失了C端和N端结构的mtSSBP1对mtDNA的复制产生抑制作用。

2.1mtSSBP1与线粒体单链DNA结合调控线粒体基因组的复制每个真核细胞中大约有10个线粒体，而每个线粒体中有10～100个mtDNA[7]，那么mtDNA拷贝数目在细胞分裂过程中是如何保持恒定的？与核DNA一样，mtDNA复制时形成复制叉，目前发现只有3种蛋白参与了复制叉的形成与维持：TWINKLE、POLG和mtSSBP1。mtDNA复制首先需要TWINKLE打开DNA双链，只要单链DNA形成，SSBP1便会选择性地与单链DNA结合并将其覆盖，阻止单链DNA退火形成双螺旋，维持DNA单链状态以保证复制进行。不仅如此，SSBP1与单链DNA结合还可以增强TWINKLE和POLG的活性。研究发现[5]，各种无功能的SSBP1突变体不仅可以导致单链DNA形成障碍，同时也引起TWINKLE和POLG活性的低下，表明SSBP1在mtDNA复制叉的形成和维持过程中发挥重要的协调作用。

2.2mtSSBP1参与mtDNA转录mtSSBP1不仅参与mtDNA复制，而且也参与mtDNA的转录，由于线粒体基因除D-loop区外均不含内含子，转录产生了多顺反子的结构。在解链过程中，mtSSBP1结合了线粒体sNA并移位保证转录顺利进行。研究发现[8]，线粒体转录因子A和mtSSBP1共同作用于D-loop环，mtSSBP1通过构象改变激活信号通路募集线粒体转录因子A等一系列蛋白，从而启动转录。为了进一步探索mtSSBP1的转录功能，有研究以秀丽隐杆线虫为生物模型，利用RNAi抑制mtSSBP1表达，发现79%的F1秀丽隐杆线虫完全不育，并伴有生殖细胞前体的抑制，最终均导致线粒体数目减少；同时，细胞处于缺氧状态，线粒体氧化复合体Ⅲ表达低下，缺氧诱导因子1表达增高。推测可能是由于mtSSBP1合成减少抑制了mtDNA的转录和翻译[9-10]。

2.3mtSSBP1参与mtDNA的保护与损伤后修复mtDNA缺乏有效的基因修复系统，而且自身结构存在缺陷，这使之极易受损。其原因可能有以下几点：①mtDNA通常是裸露的，不受组蛋白的保护，所以致癌物质易于与之结合。②线粒体内脂质含量较高，使具有嗜脂性的致癌物质往往优先在mtDNA上聚集。③mtDNA在整个细胞周期中处于不断的合成状态，易受外界因素的干扰，稳定性差。④线粒体内氧浓度较高，易产生氧自由基及过氧化氢等物质，其本身又不能合成谷胱甘肽将此类物质有效去除，因此mtDNA易受氧化物损伤，造成核酸片段丢失、碱基修饰及插入突变等。⑤在复制时由于POLG的校对性差，以及tRNA基因部位易形成发夹样结构，导致其复制错配频率高于核DNA约10倍。

研究发现[5,11]，mtSSBP1主要通过以下两种机制参与mtDNA的保护和损伤后修复。

2.3.1mtSSBP1物理隔离mtSSBP1可保护mtDNA，免于核酸酶的损伤，在复制开始时，mtSSBP1首先识别位于重链的起始点，然后像外套一样包裹在线粒体sNA上，防止单链内配对成环而形成二级结构，这对线粒体这样一个除D-loop区外，相邻的基因之间几乎无任何非编码碱基的“经济型”基因来说起到至关重要的保护作用。研究还发现，mtSSBP1和线粒体转录因子A相互协调，共同稳定mtDNA的D-loop，从而降低了D-loop环处基因的突变率[7]。

2.3.2mtSSBP1抑制在ssmtDNA上的碱基修复当mtDNA受到氧化损伤时，会产生3-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤等物质，为防止线粒体DNA碱基损伤的积累，细胞通常利用碱基切除修复途径。通过3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶识别和切除具体损伤碱基[12]，由嘌呤/嘧啶核酸内切酶1发挥作用，生成一个去嘌呤或去嘧啶的位点，由此产生的间隙由POLG填充和DNA连接酶密封。mtSSBP1就是通过3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶途径保护mtDNA，通过液相-色谱质谱分析发现mtSSBP1与3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶在线粒体中形成复合物，mtSSBP1在sNA上可以显著抑制3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶活性，从而防止线粒体sNA发生断裂[11,13]。Wollen Steen等[13]实验证实，mtSSBP还可抑制尿嘧啶DNA糖基化酶1和氧化脱甲基酶的活性，从而防止ssmtDNA 上尿嘧啶和3meC的氧化脱甲基被切除；另一方面，mtSSBP也可有效抑制脱嘌呤嘧啶内切核酸酶1和糖基化酶的活化，从而避免在线粒体sNA上产生切口。因此，mtSSBP1在线粒体sNA中起到了防止核酸酶内切形成致命的mtDNA断裂损伤的作用。mtSSBP1通过以上几种途径防止ssmtDNA断裂的形成。

3mtSSBP1与疾病发生

3.1肿瘤目前解释肿瘤发生的重要学说是“二次打击”学说，本质上是原癌基因的激活和抑癌基因的失活。在体细胞中发现的mtDNA突变表明，人类肿瘤组织中线粒体基因突变以发生在D-loop区尤为频繁，特别是在被称为D310区的区域，而mtSSBP1恰好就是作用于D-loop区[11]。mtSSBP1参与了mtDNA的复制、转录、保护以及修复过程。因此，若mtSSBP1表达失调，mtDNA会发生基因突变以及突变积累，最终可能会导致肿瘤的发生。目前发现，mtSSBP1与肝癌、乳腺癌以及卵巢癌等多种肿瘤发生有关[14-21]。

3.1.1肝癌研究发现，无论是肝癌组织还是肝癌旁组织都存在mtDNA的突变[14]。而这些突变与mtSSBP1关系密切，mtSSBP1表达失调与甲胎蛋白水平变化、癌旁卫星灶形成、肿瘤体积以及肝癌预后有一定的相关性。Ye等[15]利用蛋白质印迹分析技术和免疫组织化学法对20例肝细胞肝癌患者的线粒体蛋白质组进行分析，与对照组相比，发现其中mtSSBP1和肽基脯氨酰异构酶表达上调，推测可能是由于肿瘤细胞微环境改变，mtSSBP1蛋白不能正确折叠，而且mtSSBP1在肝癌发生过程中的上调可能与Ras-Raf-MEK-ERK通路有关。

3.1.2其他肿瘤越来越多的肿瘤研究发现[22-24]，有70%以上的肿瘤细胞存在mtDNA突变，线粒体中的蛋白质变性失活，其中作为mtDNA的“保护蛋白”mtSSBP1变异率更高。Polyak等[16]对人类10种大肠癌细胞系的线粒体基因组进行了测序，最终在7个细胞系中发现了可能影响体细胞功能的突变，其中就包括mtSSBP1。研究发现[6]，mtDNA 拷贝数与mtSSBP1表达活性呈正相关，这不仅影响mtDNA 的复制速度，还会影响mtDNA的稳定性。Shapovalov等[25]发现，侵袭性很强的肿瘤细胞中mtDNA拷贝数也明显增加，但是线粒体功能障碍。推测可能是由于mtSSBP1的表达上调使异常mtDNA过度复制，导致积累了大量没有功能的不成熟线粒体DNA前体。在EB病毒的研究中发现[17]，病毒与线粒体DNA复制的启动中有共同的起始因子，由于mtSSBP1与病毒的SSB同源，病毒的启动子与mtDNA的启动子共同竞争结合mtSSBP1，使EB病毒在裂解性溶细胞周期中抑制mtDNA的复制，导致线粒体DNA拷贝数减少，而这与由EB病毒引发的鼻咽癌有着一定的相关性。研究发现，mtSSBP1作为抑癌基因表达产物锌指蛋白331的辅助因子可抑制胃癌细胞的生长和侵袭[18]。同时，在卵巢癌的研究中发现，mtSSBP1表达上调，推测可能与肿瘤细胞的高能量代谢有关[19]。目前已知与mtDNA损伤有关的肿瘤包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、胃癌等[20-21]。由于mtSSBP1的重要功能，它的变异与mtDNA的损伤有密切关系，但是目前还没有得到mtSSBP1与细胞癌变直接相关的证据，因此mtSSBP1在肿瘤发生以及诊断中的作用等问题还值得进一步研究。

3.2与脑、心脏、肝脏等重要器官损伤的相关性脑、心肌、骨骼肌、肝脏等器官对氧气的需求大，依赖性强。因此，当线粒体拷贝数减少或者mtDNA拷贝数减少将导致氧化链的必需成分合成减少，就会造成细胞能量供应不足，引起器官损伤。Müller-Höcker等[26]报道1例由肝衰竭导致死亡的16个月男婴，除发生肝衰竭外，心肌、骨骼肌均严重受损，进一步研究后发现是由于POLG和mtSSBP1基因发生突变导致mtDNA耗竭，细胞接受死亡信号启动线粒体凋亡途径，使大量细胞同时死亡，最终导致多脏器衰竭。同时有学者发现[27]，老年痴呆症等一些神经系统疾病可能也与mtSSBP1突变有关，导致神经元中mtDNA表达异常，细胞正常氧化呼吸链受到阻断，使电子传递链中断，活性氧类在线粒体中大量积累，损伤mtDNA，最终导致大量神经元凋亡，进一步加剧疾病的发展。

3.3其他可能的相关疾病研究表明[28-29]，线粒体mtSSBP1的突变可能会导致一系列能量代谢相关性疾病的发生，包括常染色体遗传突变的外部眼肌麻痹、感觉神经病变、癫痫、共济失调帕金森病等疾病。同时，mtSSBP1与疯牛病的发生有密切关系，目前已作为自然羊瘙痒症与疯牛病的分子标志物[30]。

4结语

mtSSBP1基因是与线粒体功能紧密相关的基因，参与mtDNA的复制和转录的启动、保护mtDNA免受损伤以及损伤后修复等一系列生命活动，与很多疾病密切相关，但具体作用环节以及作用靶点尚未完全阐明。目前，有研究表明mtSSBP1基因与肿瘤的发生、进展以及细胞凋亡有密切关系，若mtSSBP1表达失调，将会抑制以p53为核心的线粒体凋亡途径[31]。然而在肝癌中，mtSSBP1与凋亡相关性方面的研究还非常有限，相信随着mtSSBP1在肿瘤凋亡方面的研究更进一步深入，将有望为肿瘤的预防、早期发现以及治疗提供新的靶点。

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Studies on mtSSBP1 and Associated DiseasesLONGPana,CHANGSonga,HUANGXiao-junb.(a.DepartmentofAerospaceMedicine,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China;b.DepartmentofBasicExperimentalTeachingCenter,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

Abstract:mtSSBP1,the mitochondria single-strand DNA protein,located on the mitochondrial matrix and proposed nuclear with the structure of homo-tetramer,plays essential roles in a series of biological behavior,including the replication,transcription,and the repair after injury of mtDNA.The expression disorder of mtSSBP1 leads to the gene mutation of mtDNA,especially under the harsh environment and conditions,such as oxidation,hydrolytic deamination,alkylation adducts,the accumulation of high levels of mtDNA damage will lead to the generation and development of various related diseases.The study of mtSSBP1 molecular mechanism and diseases related pathways is at the exploration stage at present,and here is to make a review of the recent research advances of mtSSBP1.

Key words:Mitochondria single-strand DNA protein 1; Structure; Function; Tumor

收稿日期：2015-01-04修回日期：2015-04-20编辑：伊姗

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.21.010

中图分类号：R34； R735.7

文献标识码：A

文章编号：1006-2084(2015)21-3867-04