Pax-8-PPAR-γ融合蛋白PPFP在甲状腺癌中的研究进展

辛鹏综述 秦华东审校



综 述

Pax-8-PPAR-γ融合蛋白PPFP在甲状腺癌中的研究进展

辛鹏综述 秦华东审校

甲状腺滤泡状癌；Pax-8-PPAR-γ；融合蛋白；PPFP

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在逐年增加。多数甲状腺癌发生与基因突变相关，如BRAF基因第15外显子上第1799位核苷酸T-A的转换，即密码子600的突变，Ras基因的突变，RET基因融合以及Pax-8-PPAR-γ融合基因。Pax-8-PPAR-γ融合基因导致融合蛋白PPFP的产生，其存在于约30%的甲状腺滤泡癌(FTC)中。人体及动物研究结果表明，PPFP是一种癌蛋白，虽然其具体的作用机制目前尚不清楚，但是PPFP通常被认为是野生型PPAR-γ的显性负抑制剂或起着某种激活PPAR-γ基因的作用。对于临床上一些细胞学结果不能确定的病例，检测到供体标本的融合基因是有助于临床诊断的。在PPFP阳性的甲状腺癌转基因小鼠模型中PPAR-γ激动剂吡格列酮能够取得很好的治疗效果，这表明PPAR-γ激动剂对于PPFP阳性的甲状腺癌是有益处的。

1 PPFP相关基因的基本结构及功能

1.1 Pax-8的结构及功能 Pax-8属于转录因子中的配对核基因，是正常甲状腺细胞生长和分化重要的调节因子[1]，对甲状腺球蛋白、甲状腺过氧化物酶和促甲状腺受体基因启动子起调控作用。在一项对小鼠的研究中表明，Pax-8基因缺失小鼠，虽然发育中的大脑和肾脏中有Pax-8的表达，但亦发生甲状腺缺如。Pax-8突变也是人类先天性甲状腺功能减退的原因之一[2]。Pax-8基因有12个外显子，其翻译的起始密码子为外显子2，在其蛋白质的氨基末端可以找到由外显子3、4和外显子5的前段编码的DNA结合结构域。其外显子8、外显子9及外显子10的选择性剪切可以产生5个不同的RNA转录物和蛋白质异构体(Pax-8A～Pax-8E)，其中Pax-8A是最长的异构体，且Pax-8A、Pax-8B比Pax-8C具有更强的转录活性[3]。

1.2 PPAR-γ的结构及功能 PPAR-γ属于核受体家族中的转录因子，是脂肪细胞分化的主要调节器，也是脂肪代谢及胰岛素敏感性的重要调控因子[4，5]。有证据表明PPAR-γ可能是一种肿瘤的抑制基因。PPAR-γ具有核激素受体的经典结构，PPAR基因有2个启动子，这导致其可以生产2个不同的蛋白质异构体，即PPAR-γ1和PPAR-γ2，这2种异构体结构基本一致，在转录实验中似乎有相近的功能[6]，但是其表达模式却不相同，即PPAR-γ1被广泛表达，而PPAR-γ2只在脂肪细胞中特异性表达[7，8]。

1.3 Pax-8-PPAR-γ融合基因 2000 年Kroll等[9]首次报道有关FTC中染色体 t(2;3)(q13;p25)易位, 其中Pax-8 的编码位置即为染色体 2q13 的断裂点 ,而PPARγ1 的编码区是3p25 的断裂处 , 从而导致Pax-8与PPARγ1 产生基因融合, 进而表达出一种包括Pax-8 外显子2到外显子10及全部 PPAR-γ1 在内的融合蛋白PPFP[10]。发生融合的Pax-8与一个缺少部分羧基端激活区的 Pax-8A 截断片段基本类似。因此，Pax-8融合部分的可变剪接可能导致多种PPFP亚型的出现。

2 PPFP在甲状腺癌中的作用

研究表明，通过对永生化正常甲状腺细胞(nthy-ori 3-1 cells)瞬时或稳定转染PPFP，使细胞呈现出一种加速增长的趋势，并得到了少量处于G0～G1静止状态的细胞[11]，此外，PPFP表达也使得FRTL-5大鼠甲状腺细胞DNA合成增加。几种体外培养实验的结果均为PPFP是一种癌蛋白提供了证据。

在U2OS骨肉瘤细胞系中转染PPAR-γ导致PPAR-γ应答元件的转录，而转染PPFP则没有得到相同的结果[12]，此外，PPFP与PPAR-γ的共同表达抑制了PPAR-γ介导的基因表达。证据表明PPAR-γ具有抗肿瘤或抑制肿瘤的性质，这提示PPFP的致癌效应可能是由于其抑制了内源性PPAR-γ活性所导致的。在表达PPAR-γ的甲状腺未分化癌(ATC)细胞株中，用PPAR-γ激动剂治疗增加了静止期细胞(在G0和G1)的比例， 并且细胞周期进程抑制剂p21cip1和p27kip1的表达也有所提高[13]，使得癌细胞的扩散减少[14],DNA合成也减少[14]；因此PPAR-γ可能在某些甲状腺细胞系中具有抗肿瘤的效果[15]，同时研究表明，在某些非甲状腺细胞系中也有类似的功效。动物实验也为PPAR-γ可能具有抗肿瘤性质提供了支持，例如通过对Thrb (其编码甲状腺激素受体β)基因敲除小鼠的研究，意外得到了甲状腺癌的结果，该疾病在等位基因Pparg的缺失下更加具有侵袭性[16]。

虽然上述理论说明内源性PPAR-γ是一种甲状腺癌的抑制因素，PPFP的致癌是凭借对非突变PPAR-γ的显性负效应，然而实际的情况可能要更复杂些[17]。首先正常甲状腺PPAR-γ的表达处于极低的水平[18]，其在该组织中是否有功能仍是未知的。其次，人甲状腺微阵列数据有力地表明，PPFP在这些肿瘤中有PPAR-γ样的活性[19，20]。例如，与PPFP阴性的甲状腺癌相比，PPFP阳性的甲状腺癌中上调最强烈的2个基因是AQP7和ANGPTL4[19，20]，这2个基因可以在脂肪细胞中诱导表达是众所周知的。转染实验表明，PPFP可以在甲状腺细胞和非甲状腺细胞中用PPAR-γ样方式激活AQP7启动子[19]。此外，至少在细胞培养和小鼠原位注射时，高水平内源性PPAR-γ的表达似乎有助于人类间变性(未分化的)甲状腺癌的攻击行为。最后，PPAR-γ拮抗剂在各种肿瘤细胞系有抗增殖作用[21]。

PPFP在转基因小鼠中的表达不足以引起甲状腺癌，这一点与良性甲状腺肿瘤偶尔也会表达PPFP的观察结果是一致的。然而，对于甲状腺特异性表达PPFP和Pten基因缺失的转基因小鼠(PPFPThy;PtenThy-/-mice)可以发展为转移性甲状腺癌[22]。敲除Pten基因的PPFP小鼠，引起(激活的)磷酸化的蛋白激酶B增加，与在人类PPFP阳性癌中观察到的一样[23]。蛋白激酶B的磷酸化通常在甲状腺滤泡状癌中普遍存在，并不是PPFP阳性癌特有的[24]，Nagy等[25]检测滤泡腺瘤及滤泡癌 Pten 基因突变，结果发现滤泡腺瘤几乎没有 PTEN 基因突变。

重要的是，用PPAR-γ激动剂吡格列酮治疗显著缩小了甲状腺癌的体积，并且完全预防了甲状腺特异性表达PPFP和Pten基因缺失的转基因小鼠中的转移性疾病[22]。吡格列酮可引起剩余的甲状腺癌细胞的成脂反应，表现在脂质集聚和诱导在脂肪细胞中PPAR-γ基因的表达，这与PPAR-γ在脂质形成中主调节器的作用是一致的[4]。这些结果表明，在吡格列酮的存在下，PPFP具有很强的PPAR-γ样作用[22]。

有研究表明PPFP可能通过抑制血管生成抑制体内肿瘤的发展[26]。PPFP在永生化甲状腺细胞的异位表达导致其生长增加和体外凋亡减少，这些细胞在小鼠的异种移植物中显示出抑制体内肿瘤的生长[26]。内皮细胞标志物(CD31)和VEGF(血管内皮生长因子)在异种移植肿瘤中识别表达降低的进一步调查表明，PPFP的表达抑制新生血管形成[23]。

3 PPFP与细胞转化

PPFP作用的特定机制尚待明确，在甲状腺癌中，PPFP的表达水平高于内源性PPAR-γ的10～50倍以上[19，20]。PPFP同样在Pax-8靶基因的转染实验中有混合作用。值得注意的是，PPFP包含DNA结合结构域以及PAX8和PPAR-γ的转录调控结构域。因此，PPFP介导的肿瘤发生的一个可行机制是对Pax-8和PPAR-γ下游信号通路的调节。

Pax-8是正常甲状腺细胞生长所必需的，并且在分化的滤泡细胞功能的维持中十分重要。当PPFP在人类甲状腺癌细胞系表达时，Pax-8应答基因SLC5A5、TPO、TG和TSHR(其编码促甲状腺激素受体，也被称为促甲状腺素受体)可被刺激或抑制。例如，PPFP的表达刺激SLC5A5和TPO的转录，而它用以特异性的方式抑制三酰甘油的转录[27]。在Nthyori3-1细胞中，PPFP不影响内源性甲状腺球蛋白和促甲状腺激素受体的基础表达，但抑制Pax-8的诱导甲状腺球蛋白和促甲状腺激素受体表达的能力[28]。PPAR-γ是一种在正常甲状腺细胞中表达水平极低且至今为止在该器官中没有确定功能的核激素受体。体外研究表明，PPFP能抑制野生型PPAR-γ的功能，PPFP也能有PPAR-γ样的作用方式[19，20]。有研究表明，PPFP刺激部分PPAR-γ靶基因启动子，并抑制其他PPAR-γ靶基因启动子[19,11,27]。

将表达PPFP与不表达PPFP的FTC分析数据的比较表明，PPFP阳性肿瘤有独特的转录特征[19,20,29]。有2项研究结果显示，在脂肪细胞中上调的众多PPAR-γ靶基因(例如AQP7和ANGPTL4)在PPFP阳性癌中同样上调，并且高度富含基因转录相关的通路如脂肪酸代谢和β氧化。在这2项研究中，MYCL和NRG1在PPFP阳性肿瘤中诱导表达。此外，FGFBP1、PGF和ANGPTL4(其编码促血管生成因子)的表达得到诱导，TIMP3(其编码抗血管生成因子)的表达受到抑制。然而，确定PPFP阳性甲状腺癌基因表达谱的另一组研究表明，PPFP阳性肿瘤显示与信号转导、细胞生长和平移控制相关的基因表达上调，并抑制编码核糖体蛋白基因和相关基因的表达相关。对于解释PPFP阳性癌的基因表达谱数据的重要局限是，对于肿瘤发生所必需的特定基因是未知的。

4 PPFP的临床意义

4.1 PPFP作为诊断工具 PPFP首先是在滤泡状甲状腺癌和滤泡型乳头状甲状腺癌中发现的。虽然也可以通过细针穿刺活检检测到基因突变[30]，然而，滤泡状甲状腺癌不能通过细针穿刺活检细胞学分析确诊这可能是20%～25%的甲状腺细针穿刺活检标本没有细胞学支持的重要原因。越来越多的证据表明，在这种情况下，利用分子生物学分析可以提高对良性与恶性甲状腺结节的鉴别。例如，在1项有16例PAX-8-PPARG基因的甲状腺结节患者中，尽管细胞学上没有1例活检标本的诊断为癌症[31]，但是通过外科手术切除的16例甲状腺结节中14例被发现是恶性的。这些发现表明，表达PPFP但细胞学不能确诊的甲状腺结节活检标本需要进行手术治疗。因此， PPFP的识别对于提高甲状腺结节活检中细胞学检查不确定的病例是一个很有前景的方法。

4.2 PPFP作为治疗靶点 人工合成的配体如具有胰岛素增敏活性的噻唑烷二酮是PPAR-γ有力的活化剂，适用于2型糖尿病的治疗。如上所述，PPAR-γ激动剂吡格列酮对于治疗特异性表达PPFP和Pten基因缺失的转基因小鼠模型甲状腺癌有很好的疗效，这种药物可大大缩小原发肿瘤并消除了转移性疾病[22]。这些数据表明，用吡格列酮的治疗有益于PPFP阳性的甲状腺癌患者，一个正在进行的II期临床试验证实了晚期患者不适合手术或者放射碘治疗的假说。本试验的阳性结果特别显著，因为吡格列酮已经被FDA批准用于2型糖尿病的长期治疗，而且与其他靶向化学治疗剂相比(如酪氨酸激酶抑制剂)毒性非常小。吡格列酮作为PPFP的一种配体，把这种融合蛋白转化为具有较强的PPAR-γ样作用的转录因子[22]，在小鼠中可导致表达PPFP的甲状腺癌细胞向脂肪细胞样细胞的转分化。我们推测，癌细胞获得脂肪细胞分化特征时失去了它们的恶性特征。这种观点在有限的观察中得到支持，具有全部胰岛素增敏性能的非脂肪性PPAR-γ激动剂，在特异性表达PPFP和Pten基因缺失的转基因小鼠模型甲状腺癌中没有抗癌作用[32]。因此，尽管比格列酮的促生脂作用被认为是作为糖尿病治疗的不良反应，但这种作用也许是吡格列酮在PPFP甲状腺癌的治疗作用中不可或缺的。

5 结 论

t(2;3)(q13;p25)染色体易位导致PAX-PPAR-γ基因融合和PPFP表达是30%～35%的FTC以及滤泡状甲状腺癌的驱动突变，PPFP可以作为PPAR-γ的一个显性负抑制剂，PPFP也对Pax-8靶基因有着大量的影响。从甲状腺活检的角度来说，仅仅依靠细胞学标准从良性病变中区分出FTC是不够的，因此，识别作为癌蛋白的PPFP具有重要的临床意义。虽然大多数甲状腺癌患者是由手术治愈或者进行放射碘治疗，然而对于那些局部复发或者远处转移的病例来说，这些治疗方法是很难治愈的，有必要探索新的治疗方式。由于吡格列酮的良好治疗效果，此种药物目前正在用于中晚期PPFP阳性甲状腺癌患者的研究当中，其促生脂作用可能是其疗效背后的真正原因。

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