黑土微生物丰度和多样性对邻苯二甲酸二丁酯污染的响应

黑土微生物丰度和多样性对邻苯二甲酸二丁酯污染的响应

邻苯二甲酸二丁酯（Di-n-butyl phthalate，DBP）是一种在环境中广泛存在的有机污染物，已被中国环境检测中心和美国环保署列为优先控制污染物。该研究探讨了黑土微生物丰度和多样性对不同浓度DBP（0、5、10、20和40 mg·kg-1）污染的响应。研究结果基本表明，黑土中的细菌、真菌和放线菌的生长（数量）对DBP污染均表现为被抑制效应，且在污染初期抑制效应与DBP浓度呈正相关，随着培养时间的增加有减缓的趋势，但在短期（25 d）内并未完全消除。为了确证这一结果，选择了4种有代表性的微生物，做了进一步的研究。结果同样表明自生固氮菌、亚硝酸氧化菌和磷细菌的生长均受到DBP污染的抑制，且抑制效应与DBP污染浓度呈显著性正相关（P=0.05）；但是铁细菌的生长（数量）却受到了 DBP污染的促进，且增幅与 DBP污染浓度呈现正相关。采用 RAPD方法研究表明，黑土微生物的丰富度和Shannon-Weanier多样性受到DBP污染的抑制，且10、20和40 mg·kg-1的污染浓度处理的抑制效应在25 d内并未完全消除。因此，可以得出结论：DBP污染改变了黑土微生物区系结构和功能代谢菌群数量，降低了黑土微生物的多样性与丰度，从而有可能影响黑土的生态系统功能，威胁黑土的可持续利用。

邻苯二甲酸二丁酯（DBP）；黑土；微生物区系；功能微生物；微生物多样性

邻苯二甲酸酯（Phthalate esters，PAEs）是一类人工合成的有机化合物，俗称塑化剂，主要用作塑料制品的成型剂（Wang et al.，2013）。由于长时间和大量广泛的使用，PAEs已经成为最为普遍的工业化合有机污染物，在土壤、地表水、沉积物、淡水动物、植物和蔬菜中均被检出（Yang et al.，2014）。又因其具有潜在的环境危害（Hens et al.，2003；Chen et al.，2011；Wang et al.，2015），中国环境检测中心和美国环保署已经将邻苯二甲酸二丁酯（Di-n-butyl phthalate，DBP）等PAEs列为优先控制污染物（Jin et al.，2013）。

DBP是PAEs中的主要种类，可以通过塑料薄膜、灌溉和农药等方式进入土壤环境（Michael et al.，1984）。目前，在部分东北黑土中DBP的污染已高达14.62 mg·kg-1，平均含量为7.60 mg·kg-1（Xu et al.，2008），远超过美国环保署推荐的土壤净化指导标准（0.08 mg·kg-1）（He et al.，2015；Zheng et al.，2014）。由于东北黑土是世界上仅有的三大黑土区之一，在保障我国粮食安全方面具有不可替代的作用（Liu et al.，2014），所以研究东北黑土的DBP环境行为尤为重要。

土壤微生物是反映土壤生化过程趋向的最重要指标（Orgiazzi et al.，2015），而且能够预测土壤生态系统功能的变化（Graham et al.，2014），因此，土壤微生物特征被广泛应用于评价污染土壤质量（Jusselme et al.，2013；Yang et al.，2014）。DBP污染会导致水稻土和红壤中的微生物群落改变（郭杨等，2010；谢慧君等，2009），然而黑土微生物对DBP污染的响应过程尚未明确。研究DBP污染对黑土微生物丰度和多样性的影响，对于阐释 DBP对黑土的生态毒理效应和黑土资源保护具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验地点与实验土壤制备

本试验始于2014年9月30日，在东北农业大学园艺站（哈尔滨市）的温室中进行。供试土壤取自哈尔滨香坊农场（45°41′N，126°45′E）的大豆田，为表层土壤（0～20 cm），在土壤中未检测到 DBP残留。土壤被充分混匀后，过2 mm筛，去除植物残体和石块。土壤基本性质如表1所示。

表1 试验黑土的基本性质Table 1 The basic character of experimental black soil

1.2 实验设计

DBP（纯度>99.9%）购于中国标准物质标准样品信息中心，助溶剂为丙酮，制备成 1000 mg·L-1的DBP储备液，于4 ℃冰箱内避光保存备用。

每个样品称取650 g置于1 L（12.2 cm×12 cm）花盆中，调整实验土壤湿度到田间最大持水量的80%，在25 ℃的黑暗培养箱中预培养7 d后，用DBP储备液调整土壤DBP浓度，共计5个处理，分别为对照（CK）：0 mg·kg-1，DBP1处理：5 mg·kg-1，DBP2处理：10 mg·kg-1，DBP3处理：20 mg·kg-1，DBP4处理：40 mg·kg-1。对照处理（CK）添加等量丙酮进行处理。每个处理5次重复，置于培养箱内培养。在实验期间，用恒重法保持土壤含水量30%，温度为(25±2) ℃，培养箱内相对湿度为70%±5%。分别于0、5、10、15、20和25 d取样测定土壤中的微生物学各项指标。

1.3 土壤微生物区系和代谢菌群数量的测定方法

细菌、真菌、放线菌和无机磷细菌用稀释平板法测定；亚硝化细菌、自生固氮菌和铁细菌，采取最大或然计数法（MPN）测定；同一稀释度3次重复。微生物数量以每的菌落数表示。每g干土的菌落数=(菌落或查表近似值平均数×稀释倍数)×10/g土壤干重（林先贵，2010）。

1.4 土壤微生物多样性分析

土壤微生物多样性分析采用RAPD方法，采用了 E.Z.N.A.® Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取土壤总 DNA。从一套RAPD引物（SBSA）20条（郭杨等，2010）（表2）中筛选出A05、A09、A12、A14、A16和A20共计6条扩增条带较清晰的引物用于PCR扩增。

表2 SBSA引物序列Table 2 The sequences of SBSA primers

PCR反应体系：10×Buffer 5 µL，MgCl2（25 mmol·L-1）5 µL，dNTP（10 mmol·L-1）1 µL，模板DNA 0.5 µL（10～100 ng），引物（5.1 µmol·L-1）3 µL，Taq酶（5 U·µL-1）0.5 µL，补双蒸水（ddH2O）至50 µL。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，40个循环为：94 ℃变性90 s，36 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，最后72 ℃延伸5 min。扩增产物置于1.5%的琼脂糖凝胶电泳。采用Quantity one 4.62进行量化分析。采用RAPD条带的扩增总量表征黑土微生物丰富度。

Shannon-Weanier指数的计算公式：

式中，Dsh为Shannon-Weanier指数；Ni为第i个RAPD条带的扩增量；N为土壤微生物DNA的RAPD条带的扩增总量。

1.5 数据统计分析方法

数据用 SPSS 17.0软件进行统计分析，采用SigmaPlot 12.5作图。

2 结果与分析

2.1 黑土微生物区系丰度对DBP污染的响应

由图1可知，在DBP污染过程中，黑土的细菌、真菌和放线菌数量产生了不同的变化趋势。总体而言，DBP污染导致了黑土微生物区系的改变，以抑制效应为主，随着时间的延长抑制效应逐渐减弱，但在短期（25 d）内并未完全消除。具体来说，细菌在处理后的5和10 d时，与对照相比，4个污染处理土壤中的细菌数量均显著下降，且在第5天时 DBP处理浓度与细菌数量呈显著线性负相关（r2=0.74**，n=15）；培养15 d后，5 mg·kg-1处理与对照无显著差异；10和20 mg·kg-1处理的细菌数量显著低于对照，但有随着时间推移而恢复增加的趋

势；40 mg·kg-1处理的细菌数量在15和20 d时与对照差异不显著，但是在 20 d时显著高于对照（图1A）。在DBP污染过程中，土壤中真菌数量也以抑制效应为主，其中20和40 mg·kg-1处理的抑制效应最为显著，培养20 d后5 mg·kg-1处理与对照无明显差异，在培养15 d时DBP处理浓度与真菌数量呈显著线性负相关（r2=0.67**，n=15）(图1B)。放线菌数量对 DBP污染的响应过程与真菌相似，受到DBP明显抑制，在培养5、10和15 d时，抑制效应与 DBP污染浓度呈线性负相关，且相关性极显著（r2=0.81**，r2=0.79**和r2=0.73**，n=15）（图1C）。

图1 在DBP污染过程中黑土细菌（A）真菌（B）和放线菌（C）数量的变化Fig. 1 The amount changes of bacteria (A), fungi (B) and actinomyces (C) in black soils under DBP contaminations

2.2 黑土微生物关键代谢菌群丰度对DBP污染的响应

除了整体研究，本文也对 DBP在几个关键代谢菌上的单独效应进行了研究，结果展示在图 2。黑土中的自生固氮菌数量在 DBP污染过程中表现为先抑制后促进，但是前期的抑制效应较大，在培养5和10 d时自生固氮菌数量与DBP污染浓度呈现显著负相关（r2=0.78*和r2=0.81*，n=15）在培养25 d时各处理与对照无明显差异（图2A）。黑土中的亚硝酸氧化菌数量在 25 d的培养期内，均受到DBP污染的抑制，且随着污染程度的增加，抑制程度增强，且各处理间的差异多为显著（P=0.05）（图2B）。磷细菌对 DBP污染的响应过程与自生固氮菌的相似，培养前期表现为抑制后期表现为促进，但是各处理间差异多数不显著（图2C）。然而，铁细菌对DBP污染的响应与上述菌群相反，随着污染浓度的提升，铁细菌的数量迅速增加，且增幅与DBP污染浓度呈现正相关。

2.3 黑土微生物多样性对DBP污染的响应

微生物多样性可以反映种群内及种群间的遗传多样性分布和差异，因此我们也对 DBP在微生物多样性上的效应进行了研究。通过图3可知，DBP污染降低了黑土微生物的多样性指数和丰富度；6个 RADP引物产生的条带数在 20～50之间，随着DBP浓度的增加抑制效应增强，且在污染处理第5天时，黑土微生物多样性指数（r2=0.68*，n=15）和丰度（r2=0.71*，n=15）与DBP污染浓度呈显著负相关，随培养时间的增长，有减缓的趋势，但是在25 d内并未完全消除（图3A和3B）。

3 讨论

图2 在DBP污染过程中黑土功能微生物菌群的数量变化Fig. 2 The amount changes of the metabolic microflora in black soils under DBP contaminations

图3 在DBP污染过程中黑土微生物多样性（A）和丰度（B）Fig. 3 The changes of microbial diversity (A) and richness (B) in black soil under DBP contaminations

土壤中存在着大量的微生物菌群，催化土壤中生物化学反应，参与营养元素的循环过程（Anderson，2003），其数量和活性直接关系到土壤的生态系统功能（Blagodatskaya et al.，2013）。土壤中细菌、真菌、放线菌的区系变化是衡量土壤微生物区系状况的重要指标（薛超等，2011）。本试验中，DBP污染处理后，黑土中的细菌、真菌和放线菌在培养的前15 d内均受到抑制，且抑制效应与DBP浓度呈现正相关（图1），说明DBP污染改变了黑土微生物的区系结构；在15 d后，DBP对微生物区系的抑制效应逐渐降低，低浓度处理与对照无差异，细菌数量恢复的最为明显，这可能是因为

细菌具有对污染土壤更快的适应性，在生理上对污染物能较快产生抗性（Edvantoro et al.，2003），这一结果与Edvantoro et al.（2003）在受DDT污染的土壤中微生物区系变化相类似。在黑土中也存在着大量的功能微生物菌群，且在维持黑土肥力方面起着至关重要的作用（王志刚等，2012）。结果表明，在 DBP污染过程中黑土中功能微生物菌群数量发生了变化，其中氮代谢功能菌群（自生固氮菌和亚硝酸氧化菌）与磷代谢功能菌群（无机磷细菌）均受到DBP污染的抑制，而铁细菌的数量受到了DBP污染的促进，说明 DBP污染改变了黑土中功能微生物菌群丰度，进而有可能影响黑土的物质循环与代谢。而且，这些微生物与植物的根系接触紧密，为植物提供养分促其生长（Vessey，2003），因此，DBP污染有可能通过影响土壤肥力，从而影响作物的生长（陈桐等，2015）。

生物多样性是用来评价生态系统稳定性与健康度的重要指标，郭杨等（2010）在水稻土上的研究结果表明，邻苯二甲酸酯复合污染降低了水稻土微生物的多样性，而谢慧君等（2009）在红壤上的研究结果表明，邻苯二甲酸酯污染导致土壤微生物多样性增加，Wang et al.（2015）研究结果表明，邻苯二甲酸二甲酯（DMP）污染改变了黑土微生物群落结构，降低了黑土微生物多样性。本研究发现，黑土微生物的丰富度和多样性受到 DBP污染的抑制，这与在水稻土中的研究结果相似，也与 DMP对黑土微生物多样性的影响相一致。土壤微生物多样性减少，表明土壤健康受损。且高浓度DBP（10、20和40 mg·kg-1）污染的抑制效应在25 d内未消除，说明 DBP污染导致黑土微生物多样性（至少在短期内）无法快速恢复，进而影响黑土生态系统功能（Graham et al.，2014），威胁黑土的可持续利用。

导致以上现象的原因，可能是由于酞酸酯类有机物在微生物细胞质膜上积累，降低质膜的流动性（Cartwright et al.，2000），引起黑土微生物区系、功能微生物菌群和多样性变化。但是 DBP污染过程中微生物菌群结构与功能更为精准的变化，还需要进一步解释，这一点也是下一步研究的重点。

4 结论

通过研究黑土微生物区系、功能菌群和多样性的变化发现，黑土微生物区系结构，功能代谢菌群数量和微生物的遗传多样性均受到 DBP污染的影响，这种影响有可能改变黑土的生态系统功能，从而威胁到黑土的可持续利用性。

致谢：Kui Chen教授在论文写作过程中提供了宝贵意见，谨致谢忱！

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王志刚1,2*，由义敏1，徐伟慧1，苏云鹏1，胡影1，刘帅1，胡云龙1，赵晓松1
1. 齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2. 哈尔滨工业大学市政环境工程学院，黑龙江 哈尔滨 150001

Response of the Abundance and Diversity of Microbes in Black Soil to Di-n-butyl Phthalate Contamination

WANG Zhigang1,2*, YOU Yimin1, XU Weihui1, SUYunpeng1, HU Ying1, LIUShuai1, HUYunlong1, ZHAOXiaosong1
1. Institute of Life Science and Agriculture and Forestry, Qiqihar University, Qiqihar 161006, China 2. Institute of Municipal Environment and Engineering, Harbin Industry University, Harbin 150001, China

Di-n-butyl phthalate (DBP), belonging to the family of phthalic acid esters, is a plasticizer and widely used in the world for many years. Nowadays, it has become a ubiquitous environmental pollutant and listed as an environmental priority pollutant by China's Environmental Monitoring Center and United States Environmental Protection Agency. The purpose of this study is to estimate the responses of the bacterial community, typical functional bacteria and bacterial biodiversity in black soil to DBP (0, 5, 10, 20 and 40 mg·kg-1) contamination. The results showed that the amounts of bacteria, fungi and actinomycetes in black soil were reduced by DBP contaminations, and the inhibitions, which did not disappear within 25 d, were correlated with DBP concentration. To confirm the phenomena, the further studies were performed with nitrogen fixing bacteria, nitrite-oxidizing bacteria, inorganic phosphorus bacteria and iron bacteria, separately. The similar results were obtained. However, as an exception, the growth of iron bacteria were promoted by DBP contamination. The studies, which based on RAPD method, showed DBP contamination decreased the richness and Shannon-Weanier index. Therefore, it could be drawn that DBP could impact the ecosystem functions by affecting the microflora, functional bacteria and biodiversity in black soil, and even threaten the sustainable utilization of black soil for agriculture.

Di-n-butyl phthalate (DBP); black soil; bacterial community; functional bacteria; bacterial biodiversity

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.10.020

X171.5

A

1674-5906（2015）10-1725-06

王志刚，由义敏，徐伟慧，苏云鹏，胡影，刘帅，胡云龙，赵晓松. 黑土微生物丰度和多样性对邻苯二甲酸二丁酯污染的响应[J]. 生态环境学报, 2015, 24(10): 1725-1730.

WANG Zhigang, YOU Yimin, XU Weihui, SUYunpeng, HU Ying, LIUShuai, HUYunlong, ZHAOXiaosong. Response of the Abundance and Diversity of Microbes in Black Soil to Di-n-butyl Phthalate Contamination [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(10): 1725-1730.

黑龙江省教育厅高校青年学术骨干支持计划项目（1245G068）

王志刚（1980年生），男，副教授，博士，研究方向为环境微生物学。E-mail: wzg1980830@sina.com *通信作者。

2015-05-19