高效液相色谱法同时测定参术止带糖浆中4个有效成分

马灵珍， 何胜利， 张 贇， 凌 今

（1.亳州职业技术学院药学院，安徽 亳州 236800；2.遂成药业股份有限公司，河南 新郑 451150；3.上海中医药大学附属龙华医院，上海200032；4.复旦大学药学院，上海201203；5.浙江金华广福医院，浙江金华321001）

高效液相色谱法同时测定参术止带糖浆中4个有效成分

马灵珍1， 何胜利2， 张 贇3*， 凌 今4，5

（1.亳州职业技术学院药学院，安徽 亳州 236800；2.遂成药业股份有限公司，河南 新郑 451150；3.上海中医药大学附属龙华医院，上海200032；4.复旦大学药学院，上海201203；5.浙江金华广福医院，浙江金华321001）

目的 建立高效液相色谱法测定参术止带糖浆 （山药、车前子、党参、苍术、陈皮等）中尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷4个有效成分的含有量。方法 参术止带糖浆70%甲醇提取液分析采用依利特C18色谱柱 （4.6 mm×200 mm，5μm）；以甲醇-乙腈 （3：2）与0.5%冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱；体积流量为0.9 m L/m in；柱温为室温；检测波长分别为224 nm（尿囊素）、210 nm（薯蓣皂苷元）和254 nm（京尼平苷酸和毛蕊花糖苷）。结果 尿囊素在0.085 4～1.708 0μg（r=0.999 8）、薯蓣皂苷元在0.010 6～0.212 0μg（r=0.999 2）、京尼平苷酸在0.095 8～1.916 0μg（r=0.999 5）、毛蕊花糖苷在0.145 2～2.904 0μg（r=0.999 7）范围内线性关系良好；平均加样回收率 （n=6）分别为98.4%、97.5%、97.9%、98.6%，RSD为0.69%～1.1%。结论 暂定本品每1 mL含山药以尿囊素计不得低于0.35 mg，以薯蓣皂苷元计不得低于0.040 mg；含车前子以京尼平苷酸计不得低于0.38mg，以毛蕊花糖苷计不得低于0.60mg。

参术止带糖浆；尿囊素；薯蓣皂苷元；京尼平苷酸；毛蕊花糖苷；高效液相色谱

参术止带糖浆是由山药、车前子、党参、苍术、陈皮、白术、白芍、荆芥、柴胡、甘草十味药物组成的中药复方制剂，收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二十册，具有补中健脾、疏肝解郁、化湿止带等功效，可用于临床上脾虚湿盛、肝郁气滞之带下症等症的治疗［1-2］。原标准仅对处方中的陈皮薄层鉴别和正丁醇提取物进行了控制，没有对该制剂进行定量测定研究，无法有效地控制产品的质量和有效性。同时尿囊素和薯蓣皂苷元为山药的主要成分和可测定成分［3-4］，京尼平苷酸和毛蕊花糖苷为车前子的主要成分和可测定成分［5］。本实验采用高效液相梯度洗脱法测定该制剂中尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷，为提高参术止带糖浆质量标准提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦1200高效液相色谱仪 （包括G1322A脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、Chemstation色谱工作站、G1315B可变波长检测器）。

1.2 试药 对照品尿囊素 （批号111501-200202，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h以上使用）、薯蓣皂苷元 （批号111539-200001，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h后使用）、京尼平苷酸 （批号111828-201102，纯度96.0%）和毛蕊花糖苷（批号111530-201310，纯度93.3%）均购于中国食品药品检定研究院。参术止带糖浆 （每瓶装210 m L，批 号 分 别 为 131201、131202、131203、131204、 131205、 131206、 131207、 131208、131209、131210）购于陕西中医学院制药厂；分析纯冰醋酸，购于上海埃彼化学试剂有限公司；色谱纯甲醇，购于天津市康科德科技有限公司。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件 采用依利特 C18色谱柱 （4.6 mm×200 mm，5μm）；体积流量为0.9 mL/min；甲醇-乙腈 （3：2）作为流动相A，0.5%冰醋酸溶液作为流动相B，按比例进行梯度洗脱 （0～10 min，10.0%A；10～23 min，10.0%→22.0%A；23～40 min，22.0%→38.0%A）［6-12］；检测波长（0～15 min，λ1=224 nm［13-14］；15～23 min，λ2= 210 nm［4］；23～40 min，λ3=254 nm［15］）。在上述

色谱条件下，待测成分峰与相邻峰的分离度大于2.0，理论塔板数均大于2 500。

2.2 混合对照品溶液的制备方法 精密称取对照品尿囊素8.54 mg、薯蓣皂苷元10.60 mg、京尼平苷酸9.58 mg和毛蕊花糖苷14.52 mg，分别置于20 m L的量瓶中，加入70%甲醇振摇溶解后稀释到刻度，上述溶液作为参术止带糖浆检测用对照品贮备液。然后分别精密量取各对照品贮备液10.0、1.0、10.0、10.0 mL，置于同一个50 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得尿囊素0.085 4 mg/mL、薯蓣皂苷元0.010 6 mg/mL、京尼平苷酸0.095 8 mg/mL、毛蕊花糖苷0.145 2 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备方法 精密量取参术止带糖浆10mL，置于50mL量瓶中，加入70%甲醇振摇溶解后稀释到刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，接取续滤液，作为参术止带糖浆检测用供试品溶液。

2.4 阴性对照试验 严格按照参术止带糖浆质量标准中规定的处方和生产工艺，制备山药阴性样品和车前子阴性样品，按照 “2.3”项下供试品溶液的配制方法制备各阴性样品溶液。分别精密吸取上述制备的 “2.3”项下供试品溶液、“2.2”项下混合对照品溶液以及上述两个阴性对照溶液各10μL，依法进行测定，参术止带糖浆中尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷对照品与其他组分均能达到基线分离，阴性对照溶液色谱图在对照品相应位置处无吸收峰，见图1。

图1 尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的HPLC图Fig.1 HPLC chromatogram s of aIIantoin，diosgenin，geniposidic acid and verbascoside

2.5 线性关系考察 精密称取尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷对照品各适量，加入70%甲醇分别制成0.854 mg/mL、0.106 mg/mL、0.958 mg/mL、1.452 mg/mL的对照液。分别精密吸取上述各对照液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mL至10 m L量瓶中，用70%甲醇稀释制成系列质量浓度的混合对照液，精密吸取各质量浓度混合对照液10.0μL，注入色谱仪中，按上述色谱条件进行测定，以峰面积Y对进样量X拟合，得回归方程为尿囊素Y=2.354 9×106X-367.2，r=0.999 8；薯蓣皂苷元Y=1.756 1×106X+201.4，r=0.999 2；京尼平苷酸Y=2.825 1×106X+412.4，r=0.999 5；毛蕊花糖苷Y=2.349 2×106X+351.9，r=0.999 7。尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷分别在0.085 4～1.708 0μg、0.010 6～0.212 0μg、0.095 8～1.916 0μg、0.145 2～2.904 0μg范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.6 精密度试验 精密吸取 “2.2”项下的混合对照品溶液（尿囊素0.085 4 mg/mL、薯蓣皂苷元0.010 6 mg/mL、京尼平苷酸0.095 8 mg/m L、毛蕊花糖苷0.145 2 mg/mL），连续进样6次测定，记录尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的峰面积，尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的RSD分别为0.49%、0.92%、

0.63%和0.47%。结果表明，该仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 取同一个批号 （批号为131201）的参术止带糖浆6份，平行制备6份供试品溶液进样测定，计算，求得尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的 RSD均小于1.0%。

2.8 稳定性试验 取同一个批号 （批号为131201）的参术止带糖浆制备的供试品溶液，分别在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后，每次进样10μL，测定其峰面积值，求得尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的RSD分别为0.38%、0.76%、0.54%和0.29%。结果表明，参术止带糖浆室温下放置24 h内稳定。

2.9 加样回收试验 精密量取已知成分含有量（尿囊素为0.426 mg/m L，薯蓣皂苷元为0.054 mg/mL，京尼平苷酸为0.482 mg/mL，毛蕊花糖苷为0.728 mg/mL）的同一批号参术止带糖浆共9份，5.0 mL/份，分别置于9个50 mL的量瓶中，精密吸取20 mL、25 mL、30 m L“2.2”项下配制的混合对照品溶液各3份，然后70%甲醇分别稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得加样供试液，按上述方法进样测定，分别计算回收率，结果见表1。

2.10 样品测定 取10个批次的参术止带糖浆，按 “2.3”项下供试品制备方法，按 “2.1”项下色谱条件，精密吸取供试品溶液和 “2.2”项下混合对照品溶液各10μL，按外标法测定本品中尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷含有量，所测结果见表2。

3 讨论

3.1 流动相的选择 分别以甲醇-水［3，7］、甲醇-磷酸二氢钾水溶液［8］、甲醇-0.5%冰醋酸溶液［9］、甲醇-乙腈 （3：2）与0.5%冰醋酸溶液［10］为流动相不同比例进行梯度洗脱，结果以甲醇-水、甲醇-磷酸二氢钾水溶液为流动相梯度洗脱时尿囊素和薯蓣皂苷元分离效果良好，而京尼平苷酸和毛蕊花糖苷未达到基线分离；以甲醇-0.5%冰醋酸溶液为流动相梯度洗脱时京尼平苷酸和毛蕊花糖苷与其他色谱峰能达到基线分离，但尿囊素和薯蓣皂苷元拖尾现象严重。而甲醇-乙腈 （3：2）与0.5%冰醋酸溶液为流动相按照文中比例梯度洗脱时4组分均能达到基线分离。故选用甲醇-乙腈 （3：2）与0.5%冰醋酸溶液按照本实验中比例为流动相进行梯度洗脱。

表1 尿囊素、薯蓣皂苷元、京尼平苷酸和毛蕊花糖苷回收率试验结果Tab.1 Resu Its of recovery tests for aIIantoin，diosgenin，geniposidic acid and verbascoside

表2 样品含有量测定结果（mg/m L）Tab.2 Resu Its of content determ ination of samp Ies（mg/m L）

3.2 各成分含有量限度的确定 根据本实验测定的各成分含有量的平均值，结合实际生产情况，取所测平均值的80%作为制剂中各成分的暂定含有量，即暂定本品每1 mL含山药以尿囊素计不得低于0.35 mg，以薯蓣皂苷元计不得低于0.040 mg；含车前子以京尼平苷酸计不得低于0.38 mg，以毛蕊花糖苷计不得低于0.60 mg。

［1］ 国家药品标准 （中药成方制剂）：第二十册［S］. 1998：155.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：27，63，附录30，附录36.

［3］ 郑 琴，胡鹏翼，龚莹莹，等.HPLC法测定不同产地山药饮片中尿囊素和腺苷的含量［J］.江西中医学院学报，2013，25（3）：32-35.

［4］ 李来玲.山药的质量评价研究［D］.济南：山东中医药大学，2011.

［5］ 邱倬星，熊学敏，胡晓艳，等.车前子超微速溶饮片中京尼平苷酸与毛蕊花糖苷的含量测定［J］.中国医药科学，2013，3（5）：41-43.

［6］ 林 林，刘广桢，尹宁宁，等.HPLC法测定金匮肾气丸中马钱苷、芍药苷、毛蕊花糖苷和丹皮酚［J］.中成药，2012，34（11）：2137-2140.

［7］ 王 玲，王 东.不同产地山药中尿囊素含量的HPLC测定［J］.河南中医学院学报，2006，21（126）：20-22.

［8］ 张芳芳，李伟东，杨光明，等.HPLC法测定麸炒山药饮片中尿囊素的含量［J］.南京中医药大学学报，2010，26（2）：146-148.

［9］ 邱广仁，赵向阳.HPLC法测定咳嗽枇杷糖浆中京尼平苷酸和毛蕊花糖苷［J］.安徽医药，2013，17（4）：573-574.

［10］ 侯 颖.HPLC法测定蠲痹抗生丸中儿茶素、表儿茶素、松果菊苷和毛蕊花糖苷［J］.中成药，2013，35（12）：2649-2653.

［11］ 张华锋，李晓坤，杨 云，等.正交设计法优选怀山药软化切制工艺［J］.中成药，2013，35（2）：360-363.

［12］ 江月华.HPLC梯度洗脱法同时测定复方荆芥熏洗剂中的升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、齐墩果酸和熊果酸含量［J］.中南药学，2014，12（5）：472-475.

［13］ 林世和，易艳东，陈 军，等.高效液相色谱法测定山药配方颗粒中尿囊素的含量［J］.中国医院药学杂志，2013，33（14）：1203-1204.

［14］ 黄玉仙，易 骏，昊岩斌，等.不同山药种质资源的尿囊素含量比较研究［J］.福建中医药，2011，42（2）：50-52.

［15］ 王隶书，王友联，李明洋，等.HPLC测定市售车前子中毛蕊花糖苷的含量［J］.中国药师，2011，14（11）：1581-1582.

Sim u Itaneous determ ination of four active ingredients in Shenzhu Zhidai Syrup by HPLC

MA Ling-zhen1， HE Sheng-li2， ZHANG Yun3*， LIN Jin4，5

（1.School of Pharmacy，Bozhou Vocational and TechnicalGollege，Bozhou 236800，Ghina；2.Suicheng PharmaceuticalGo.，Ltd，Xinzheng 451150，Ghina；3.Longhua Hospital Affiliated to ShanghaiUniversity of Traditional GhineseMedicine，Shanghai200032，Ghina；4.School of Pharmacy，Fudan University，Shanghai201203，Ghina；5.Guangfu Hospital，Jinhua 321001，Ghina）

AIM To develop a high-performance liquid chromatography（HPLC）method for simultaneously determining the contents of four main ingredients（allantoin，diosgenin，geniposidic acid and verbascoside）in Shenzhu Zhidai Syrup（Dioscoreae Rhizoma，Plantaginis Semen，Godonopsis Radix，Atractylodis Rhizoma，Gitri reticulatae Pericarpium，etc.）.METHODS A Hypersil C18column was used for chromatographic separation of 70%methanolic extractof Shenzhu ZhidaiSyrup.Themobile phase consisted ofmethanol-acetonitrile（3：2）and 0.5%glacial acetic acid solution in a gradient elution manner，with the column maintained at room temperature，the flow rate at0.9 mL/min，and the detection wavelengths were set at 224 nm for allantoin，210 nm for diosgenin，and 254 nm for geniposidic acid and verbascoside.RESULTS There were good linear relationships among allantoin，diosgenin，geniposidic acid and verbascoside，and the peak area values with their concentrations kept within the ranges of 0.085 4-1.708 0μg（r=0.999 8），0.010 6-0.212 0μg（r=0.999 2），0.095 8-1.916 0μg（r=0.999 5）and 0.145 2-2.904 0μg（r=0.999 7），respectively.The average recoveries were 98.4%，97.5%，97.9%and 98.6%，respectively，with RSD of0.69%-1.1%.CONCLUSIONS The tentative standard for each 1 mL is fixed at least no less than 0.35 mg allantoin and 0.040 mg diesgenin of Dioscoreae Rhizoma，0.38 mg geniposidie acid and 0.60 mg verbascoside of Plantaginis Semen.

Shenzhu Zhidai Syrup；allantoin；diosgenin；geniposidic acid；verbascoside；HPLC

R927.2

A

1001-1528（2015）11-2422-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.018

2014-12-16

安徽省高等学校教学质量与教学改革工程实测中心建设项目 （20101460）

马灵珍 （1982—），男，硕士，讲师，主要从事中药生产与质量控制研究教学工作。Tel：15905677087，E-mail：hhjj-0000 @163.com

*通信作者：张 贇 （1986—），女，药师，从事中西药临床合理用药工作。E-mail：hhjj_0000@163.com