醒脑通络片对脑缺血损伤大鼠内源性神经干细胞的影响

郭建队， 田 华， 黄毓娟， 方 瑜

（陕西中医学院，陕西咸阳712046）

醒脑通络片对脑缺血损伤大鼠内源性神经干细胞的影响

郭建队， 田 华， 黄毓娟， 方 瑜

（陕西中医学院，陕西咸阳712046）

目的 观察醒脑通络片 （黄芪、川芎、桃仁、红花、鸡血藤等）对脑缺血损伤大鼠内源性神经干细胞的影响。方法 将120只SD大鼠随机分为假手术组和模型组 （生理盐水灌胃），醒脑通络片小、中、大剂量组5组，每组各24只，采用线栓法致大鼠脑缺血再灌注损伤模型。脑缺血再灌注后3、7、14、28 d时，神经功能评分后处死动物，用免疫组化法观察缺血侧海马溴脱氧尿嘧啶核苷 （BrdU）、巢蛋白 （Nestin）的表达。结果 假手术组海马区仅有少量BrdU、Nestin阳性细胞表达，模型组及醒脑通络片各组再灌注3 d后BrdU、Nestin阳性细胞表达开始增多，7～14 d达高峰，28 d明显下降。和模型组比较，醒脑通络片各组BrdU、Nestin阳性细胞明显增多 （P＜0.05或0.01）。醒脑通络片各组在再灌注14和28 d神经功能均显示恢复，和模型组比较有显著性意义 （P＜0.05或0.01）。结论 醒脑通络片可以促进内源性神经干细胞增殖、分化，可能为其治疗缺血性脑血管病的机制之一。

醒脑通络片；脑缺血再灌注损伤；溴脱氧尿嘧啶核苷 （BrdU）；巢蛋白 （Nestin）；神经干细胞；增殖

内源性神经干细胞（neural stem cell，NSC）主要存在于成年哺乳动物海马齿状回颗粒下层 （subgranular zone，SGZ）和侧脑室室管膜下区（（subventricular zone，SVZ）［1］。正常情况下，这些神经干细胞处于休眠状态，在病理状态时如中风、癫痫、帕金森病等，这些细胞可以增殖、分化、迁移并整合到神经网络修复神经功能［2］。缺血性脑血管病发生后神经细胞再生可以活跃数天甚至数周，被认为是治疗的第二时间窗［3］。用药物调控内源性NSC的增殖、分化、迁移，促进神经功能修复就成为当前研究的热点之一。近年来研究发现，黄芪、川芎、绞股蓝等中药的提取物黄芪甲苷［4］、川芎嗪［5］、绞股蓝总苷［6］和参芎滴丸［7］复方均能促进神经细胞增生。醒脑通络片是陕西省名老中医杨秀清教授结合三十多年临床经验，根据中风病机以气虚为根本，渐致脏腑功能、气血阴阳失调，气虚血瘀，痹阻脑脉，脑窍失利组方配伍。其主要组成为黄芪、川芎、桃仁、红花、鸡血藤、地龙、水蛭、女贞子、决明子、冰片。经陕西中医学院附属医院长期临床实践证实，醒脑通络片是临床治疗缺血性中风的有效经验方［8］。以往的研究显示醒脑通络片具有改善微循环、清除自由基等作用。为进一步探索醒脑通络片治疗缺血性脑血管病的机理，本实验观察醒脑通络片对缺血大鼠内源性神经干细胞BrdU、Nestin表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 健康SD大鼠120只，雌雄各半，日龄60 d，体质量250～300 g，SPF级。购自西安交通大学医学院实验动物中心。动物合格证号SCXK（陕）2012-003。

1.2 药品及试剂 醒脑通络片，陕西中医学院附属医院制剂中心提供，批号20130320。经研磨、生理盐水溶解，配制成小剂量14.12mg/mL（含生药0.042 g/mL），中剂量28.24 mg/m L（含生药0.084 g/mL），大剂量56.48 mg/mL（含生药0.168 g/mL）的溶液。5-溴脱氧尿嘧啶核苷 （5-bromo-2-deoxyuridin，5-BrdU）（Sigma-Aldrich，美国）；小鼠anti-BrdU单克隆抗体（Sigma-Aldrich，美国）；兔抗巢蛋白（anti-nestin）多克隆抗体（Sigma-Aldrich，美国）。酶联免疫吸附测定试剂盒及DAB显色试剂盒 （武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 实验仪器 TB-718E型生物组织包埋机（湖北泰维科技实业有限公司）；DQP-9010切片机（上海医疗仪器厂）；Leica数码显微镜。

1.4 造模及分组 进行适应性喂养7 d后，参照Zea-longa［9］法行线栓法阻断大鼠大脑中动脉以制作局灶性脑缺血动物模型。造模成功后，随机分为假手术对照组、模型对照组、醒脑通络片小、中、大剂量组。假手术组除实施假手术外，造模过程同模型组，每组24只大鼠。

醒脑通络片3组于术后24 h开始给予醒脑通络片灌胃，每次分别为小剂量组0.28 g/kg、中剂量组0.56 g/kg、大剂量组1.12 g/kg，每天2次，直到处死前1 d。模型组、假手术组给予生理盐水（6.7 mL/kg）灌胃。5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-BrdU）用生理盐水溶解，腹腔注射 （下腹中点旁开1 cm），每组动物于处死前2 d开始给药，12 h一次，每次50 mg/kg，共3次。

1.5 神经病学评分 参照Zea-longa［9］评分制，即0分，无神经功能缺损；1分，提尾悬空不能伸展右侧前爪；2分，行走向右侧转圈；3分，行走困难，并向右侧倾倒；4分，不能自发行走，无意识或昏迷。

1.6 脑组织切片制备 模型组和中药组分别在脑缺血2 h再灌注后3、7、14、28 d各取6只处死取材：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪开胸腔，充分暴露心脏，经左心室插入灌注针至升主动脉，动脉夹固定，剪开右心耳，用生理盐水200 mL经动脉快速灌注，直到肝和肺脏颜色转白及右心房流出液澄清；继续用4%多聚甲醛缓冲固定液约200 mL动脉内灌注，持续30 min，至大鼠尾巴和四肢明显僵硬后，断头取脑，标本置于4%多聚甲醛缓冲固定液；固定12 h后，脑组织冠状切开以显露海马齿状回；继续固定海马组织，24 h后将脑组织用酒精脱水，脱水后的标本经二甲苯透明，透明后的组织常规石蜡包埋、切片，片厚3μm，并将切片贴在防脱载玻片上，用恒温烤箱60℃烤片12 h；选取缺血侧海马区域的脑组织切片染色，假手术组取对应位置的脑组织切片染色。

1.7 免疫组织化学方法检测BrdU、Nestin表达石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水冲洗，0.01 M PBS浸泡5 min。室温下，滴加新鲜的3%H2O2孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶；用0.01 M PBS冲洗，每次5 min，共3次。滴加5%～10%正常山羊血清封闭液，室温孵育10 min，甩去多余液体，勿洗。滴加一抗50μL，37℃孵育1 h；再用0.01 M PBS冲洗，每次5 min，共3次。滴加生物素化

二抗40～50μL，37℃孵育30 min；最后用0.01 M PBS冲洗，每次5 min，共3次。显色剂显色3～15 min（DAB），自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。在显微镜下观察染色结果，阳性细胞呈棕黄色，BrdU定位于细胞核，Nestin定位于细胞浆，每只大鼠取缺血侧齿状回部位切片各3张，每张切片随机选取5个非重叠视野，计数BrdU、Nestin阳性细胞数，计算阳性细胞数均值 （400倍视野）。

1.8 数据分析和统计处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。多组数据间差异的显著性分析用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐性检验用Levene法，方差齐时用Tukey法，方差不齐时用Games-Howell法检验。

2 结果

2.1 神经功能缺失评分 结果见表1。假手术对照组无神经功能缺损。醒脑通络片各剂量组在再灌注7、14、28 d时，神经功能症状比模型组明显减轻，与模型组比较有显著性差异 （P＜0.05或0.01）。

表1 各组神经功能缺失评分比较Tab.1 Comparison of neuro IogicaI function deficit scores in each group

表1 各组神经功能缺失评分比较Tab.1 Comparison of neuro IogicaI function deficit scores in each group

注：与同时间点模型组比较，△P＜0.05，■P＜0.01；与同时间点假手术组比较，●P＜0.01

28 d假手术组 —组别 剂量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型组 — 3.17±0.41● 3.00±0.63● 2.17±0.41● 1.50±0.55●醒脑通络片组 0.28 2.83±0.41 2.00±0.63△ 1.17±0.75△ 0.50±0.55△醒脑通络片组 0.56 2.83±0.41 1.67±0.52■ 0.67±0.52■ 0.33±0.52■醒脑通络片组 1.12 2.83±0.41 1.50±0.55■ 0.50±0.55■ 0.17±0.41■

2.2 各组脑缺血再灌注各时间点BrdU阳性细胞数 结果显示，假手术组大鼠海马齿状回SGZ区有少量BrdU阳性细胞散在分布，模型组再灌注各时间点缺血侧海马齿状回SGZ区BrdU阳性细胞数比假手术组明显增加，与假手术组比较有显著性差异 （P＜0.01）。醒脑通络片各剂量组再灌注各时间点缺血侧海马齿状回SGZ区BrdU阳性细胞数比模型组缺血侧同部位明显增加，与模型组比较具有显著性差异 （P＜0.01），（见表2、图1，BrdU阳性细胞细胞核呈棕黄色，×400）。

表2 各组各时间点BrdU阳性细胞数比较Tab.2 Com parison of BrdU positive ceIIs at each time point in each group

表2 各组各时间点BrdU阳性细胞数比较Tab.2 Com parison of BrdU positive ceIIs at each time point in each group

注：与同时间点模型组比较，■P＜0.01；与同时间点假手术组比较，●P＜0.01

28 d假手术组 —组别 剂量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注10.67±0.82 10.67±1.21 10.50±1.38 10.33±1.21模型组 — 15.17±0.75● 20.33±1.03● 24.33±1.21● 16.33±1.03●醒脑通络片组 0.28 17.83±0.75■ 40.00±1.41■ 46.00±1.26■ 19.50±1.05■醒脑通络片组 0.56 19.00±0.89■ 43.17±1.47■ 47.33±1.21■ 24.00±1.26■醒脑通络片组 1.12 20.17±0.75■ 44.50±1.38■ 52.00±1.41■ 24.17±1.60■

2.3 各组脑缺血再灌注各时间点Nestin阳性细胞数 结果显示，假手术组大鼠海马区有少数散在Nestin阳性细胞，模型组再灌注各时间点Nsetin阳性细胞数比假手术组增加，模型组和假手术组比较有显著性差异 （P＜0.05或0.01）。醒脑通络片各剂量组再灌注各时间点Nestin阳性细胞数比模型组增加，与模型组比较具有显著性差异 （P＜0.05或0.01），（见表3、图2，Nestin阳性细胞胞浆呈棕黄色，×400）。

表3 各组各时间点Nestin阳性细胞数比较Tab.3 Com parison of Nestin positive ceIIs at each time poin t in each group

表3 各组各时间点Nestin阳性细胞数比较Tab.3 Com parison of Nestin positive ceIIs at each time poin t in each group

注：与同时间点模型组比较，△P＜0.05，■P＜0.01；与同时间点假手术组比较，○P＜0.05，●P＜0.01

28 d假手术组 —组别 剂量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注8.00±0.89 8.17±0.75 8.33±0.82 8.00±0.89模型组 — 9.33±0.52○ 12.00±0.63● 13.83±0.75● 11.17±0.75○醒脑通络片组 0.28 11.83±0.75■ 14.17±0.75■ 18.17±0.75■ 12.67±0.52△醒脑通络片组 0.56 12.50±0.55■ 16.00±0.63■ 22.00±0.89■ 14.50±0.84■醒脑通络片组 1.12 12.67±0.52■ 20.00±0.63■ 29.83±0.75■ 16.83±0.98■

图1 五组脑缺血再灌注14 d后缺血侧海马区BrdU染色 （×400）Fig.1 BrdU stainings of the hippocampus ischem ia sides after the 14th day with cerebraIischem iareperfusion in five groups

3 讨论

脑血管病因其高发病率、高死亡率、高致残率及高复发率的特点，已成为威胁人类健康的主要疾病之一，其中缺血性脑血管病大约占70%。急性缺血性脑血管病的治疗目前主要以溶栓、改善脑循环、保护脑细胞治疗为主。然而由于有限的治疗时间窗，能够早期溶栓治疗的病人很少，而且脑保护剂的作用有限，因此，目前缺血性脑血管病的治疗效果并不理想。神经干细胞（Neural stem cell，NSC）是指能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，并具有自我更新和增殖能力的细胞［10］。分为内源性和外源性两类，凡是来源于生物体神经系统内的为内源性NSC，而从外界导入的神经干细胞为外源性NSC。由于NSC具有不断增殖、分裂，自我更新、自我维持，多向分化潜能等生物特性，具备神经功能修复的基础。研究如何用NSC治疗神经系统疾病成为目前的热点。

图2 五组脑缺血再灌注14 d后缺血侧海马区Nestin染色 （×400）Fig.2 Nestin stainings of the hippocampus ischem ia sides after the 14th day w ith cerebra I ischem iareperfusion in five groups

BrdU是胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞增殖周期的S期竞争掺入细胞单链DNA，被认为是细胞增殖的标记物。NSC发生分裂增殖后，BrdU可作为底物掺入DNA合成，用以标记增殖的NSC。研究表明，脑缺血可促进成年哺乳动物大脑SVZ区和海马齿状回SGZ区NSC增殖、分化、迁移，并到达损伤区取代部分坏死神经元［11-13］。Clausen等研究发现，脑缺血损伤后增殖的神经干细胞可迁移到坏死区周围，并表达锥体细胞标志物，这些细胞可能参与修复缺损神经功能［14］。巢蛋白 （Nestin）是一种特殊的中间丝蛋白，在胚胎神经干细胞开始表达，当神经干细胞迁移、分化基本完成后，其表达便开始减弱并逐渐停止，最终被其它中间丝蛋白替代［15］。Nestin定位于细胞质，可被nestin抗体特异性识别，是早期未分化状态神经干细胞的抗原标志，被视为NSC特异性标记蛋白，用于神经干细胞的鉴定［16］。研究显示，大鼠脑缺血损伤后6 h，海马区NSC开始表达nestin，7 d后达到高峰，持续时间4周［17］。近来另有研究发现，给局灶性脑缺血大鼠颈内动脉注入NSC后，NSC

能够迁移到缺血区，并存活、分化为神经元和星形胶质细胞，神经功能恢复明显优于单纯注入NSC培养液［18］。这从另一方面说明NSC可以迁移到缺血区并分化为神经元修复神经功能。

本实验结果显示，醒脑通络片能够促进局灶性脑缺血大鼠神经功能改善，与模型组再灌注7、14、28 d比较有统计学意义 （P＜0.05或0.01）。正常成年大鼠脑组织中，海马齿状回SGZ区和SVZ区只有少量BrdU、Nestin阳性细胞，缺血性脑损伤后，患侧上述两区的神经干细胞发生增殖、分化。本实验显示，脑缺血再灌注3 d后BrdU、Nestin阳性细胞开始增加，7～14 d达到高峰，28 d明显下降。表明缺血性脑损伤可以诱导内源性NSC增殖、分化，这与He等的研究结果相符［17］。内源性NSC在缺血性脑损伤后增殖、分化以及向损伤区迁移，说明其可能参与了受损神经组织修复，使部分丧失的神经功能得以改善。醒脑通络片各剂量组均可使BrdU、Nestin阳性细胞增加，与同时间点模型组比较有统计学意义 （P＜0.05或0.01），说明醒脑通络片能够促进内源性NSC增殖、分化，提示醒脑通络片促进局灶性脑缺血大鼠神经功能缺损改善可能与促进NSC增殖、分化有关。其具体机制有待进一步研究。

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Effect of Xingnao Tong Iuo Tab Iets on endogenous neuraIstem ceIIs in rats w ith cerebraIischem ia injury

GUO Jian-dui， TIAN Hua， HUANG Yu-juan， FANG Yu

（Shaanxi Gollege of Traditional Ghinese Medicine，Xianyang 712046，Ghina）

AIM To observe the effectof Xingnao Tongluo Tablets（XNTLT）（AstragaliRadix，Ghuanxiong Rhizoma，Persicae Semen，Garthami Flos，Spatholobi Gaulis，etc.）on endogenous neural stem cells in rats with cerebral ischemia injury.METHODS One hundred and twenty healthy SD ratswere randomly and equally divided into the sham operation control group andmodel group（physiological saline both），low，medium and high-dose XNTLT groups.Middle cerebral artery occlusionmodelwasmade by string ligation.BrdU and Nestin positive cells were observed with immunohistochemistry after ischemia-reperfusion on the 3rd，7th，14th and 28th day，respectively，prior to the assessment of eurologic function score.RESULTS Only few of BrdU and Nestin positive cells were observed in hippocampus of the sham operation group.However，the BrdU and Nestin positive cells of other four groups began to increase on the 3rd day，peaks occurred from the7th to the 14th day and decreased obviously on the 28th day after ischemia-reperfusion.Compared with themodel group，the BrdU and Nestin positive cells significantly increased in the XNTLT groups（P＜0.05 or 0.01）.The neurologic function recovered significantly in the XNTLT groups on the 14th and 28th day after ischemia-reperfusion with significant difference（P＜0.05 or 0.01）.CONCLUSION XNTLT promote the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells，which may be one of itsmechanisms of action in treating cerebral ischemia.

Xingnao Tongluo Tablets；cerebral ischemia injury；BrdU；Nestin；neural stem cells；proliferation

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2352-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.004

2014-12-23

咸阳市科技计划项目 ［2012k16-01（8）］

郭建队 （1970—），男，硕士，从事中医脑病临床基础研究。Tel：18691032725，E-mail：gjd1382@163.com