扎考比利对大鼠离体冠状动脉环的舒张作用及其机制

2015-12-08刘成芳王瑾刘宇和荣丽张卫国牛龙刚吴博威

中国循环杂志 2015年12期

刘成芳，王瑾，刘宇，和荣丽，张卫国，牛龙刚，吴博威

刘成芳，王瑾，刘宇，和荣丽，张卫国，牛龙刚，吴博威

目的：研究扎考比利（zacopride）舒张大鼠冠状动脉环的作用及其可能机制。

方法：雄性SD大鼠冠状动脉环的张力舒缩状态采用PowerLab和DMT系统记录，SD大鼠随机分为4组，内皮完整[+Endo, +Endo（vehicle）]组、+Endo（zacopride）组、完全去除内皮[-Endo, -Endo（vehicle）]组和-Endo（zacopride）组，每组6只大鼠，观察zacopride对KCl、血管收缩剂血栓素A2类似物（U46619）预收缩离体大鼠冠状动脉环的舒张作用；研究不同作用类药物对zacopride舒张血管作用的影响。

结果：在+Endo（zacopride）组和-Endo（zacopride）组，Zacopride对 KCl（60 mmol/L）和 U46619 （10-6mol/L）预收缩的冠状动脉环呈现浓度依赖性地舒张作用，+Endo（zacopride）组Zacopride 对 KCl 和 U46619 预收缩冠状动脉的最大舒张幅度分别为（90.15±6.38）% 和（81.67±4.97）%，-Endo（zacopride）组 zacopride 对 KCl 和 U46619预收缩冠状动脉的最大舒张幅度分别为（85.48±5.04）% 和（79.65±3.51）%，两组zacopride 对 KCl 和 U46619 预收缩冠状动脉的最大舒张幅度都显著高于其+Endo（vehicle）组和-Endo（vehicle）组，差异有统计学意义（P＜0.05）；内向整流钾通道（IK1）阻断剂 BaCl2明显减弱 zacopride 的舒张血管作用，使zacopride对 KCl 和U46619 预收缩动脉环的最大舒张幅度均减小（P＜0.05），差异有统计学意义。而一氧化氮合酶抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-NAME）、钙激活钾通道阻断剂四乙胺（TEA）、三磷酸腺苷敏感性钾通道阻断剂格列苯脲（Glib）和电压依赖性钾通道阻断剂 4-氨基吡啶（4-AP）对 zacopride 的舒张血管作用没有明显影响（P均＞ 0.05）。

结论：Zacopride 对 KCl 和 U46619预收缩大鼠冠状动脉环有明显的舒张作用；Zacopride对冠状动脉的舒张作用与激动IK1通道有关。

扎考比利；冠状动脉；血管舒张；内向整流钾通道

Objective: To investigate the effect with its possible mechanisms of zacopride on vasodilatation of isolated coronary arterial rings in experimental rats.

Methods: The tension of vasodilatation of isolated coronary arterial rings of male SD rats was recorded by Powerlab and DMT system. The rats were divided into 4 groups: +Endo (vehicle) group, +Endo (zacopride) group and -Endo (vehicle) group, –Endo (zacopride) group. n=6 in each group. The vasodilatation effects of zacopride on KCl (60 mmol/L) and U46619 (10-6mol/L) pre-constricted arterial ring were recorded; the effects of different agents on zacopride caused vasodilatation were studied.

Results: In both +Endo (zacopride) and –Endo (zacopride) groups, zacopride showed a dose dependent vasodilatation effect on coronary ring pre-constricted by KCl and U46619. The maximum vasodilatation effect of zacopride in KCl treated +Endo (zacopride) group was (90.15 ± 6.38) %, in U46619 treated-Endo (zacopride) group was (81.67 ± 4.97 ) %; themaximum vasodilatation effect of zacopride in KCl treated-Endo (zacopride) group was (85.48±5.04) %, in U46619 treated–Endo (zacopride) group was (79.65 ± 3.51) %, compared to each corresponding vehicle group, all P＜0.05. The inhibitor of IK1 channel, BaCl2could signifcantly reduce the vasodilatation effect of zacopride in KCl and U46619 pre-constricted coronary ring, P＜0.05. However, the inhibitor of eNOS (L-NAME), the blocker of KCachannel (TEA), blocker of Kv channel (4-AP) and blocker of KATP channel (Glib) had no such signifcant effects, all P＞0.05.

Conclusion: Zacopride had vasodilatation effect on coronary arterial ring which was pre-constricted by KCl and U46619, which might be related to the channel of IK1.

(Chinese Circulation Journal, 2015,30:1212.)

扎考比利（zacopride），属于苯甲酰胺衍生物，为5-HT4受体激动剂和5-HT3受体阻断剂，是一种全胃肠动力药[1]。近年来国内外学者还发现zacopride具有促进呼吸、止吐和抗焦虑等作用[2-4]。在心血管方面的研究中，本课题组前期研究发现并证实了zacopride对大鼠心室肌内向整流钾通道（IK1）具有显著的激动作用，并且zacopride通过激动IK1可以抑制触发性心律失常和缺血性心律失常[5-7]。Liao等[8]和Wu等[9]的研究发现，Zacopride可加强缺血后适应和减轻离体心脏的缺血/再灌注损伤，这些研究从不同侧面观察到zacopride对心脏损伤的保护作用。但关于zacopride对冠状动脉的作用还少见报道，因此本研究拟通过离体血管张力测定实验观察zacopride对成年大鼠离体冠状动脉环的舒张作用，并分析其可能的舒张机理。

1　材料和方法

实验动物: 清洁级雄性 SD 大鼠，体重 240～260 g，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK( 晋) 2009-0001。

实验试剂及仪器: Zacopride hydrochloride，购于英国Tocris公司；苯肾上腺素（PE）、乙酰胆碱（Ach）、左旋硝基精氨酸甲酯（L-NAME）、4-氨基吡啶（4-AP）、格列苯脲（Glib）、四乙胺（TEA）和血栓素A类似物（U46619）均购自美国 Sigma 公司；其余试剂为市售分析纯。HEPES缓冲液的成分及其浓度（mmol/L）如下：NaCl：144，KCl：5.8，MgCl2：1.2，CaCl2：2.5，葡萄糖：11.1，HEPES：5，pH=7.38。610 M多通道血管张力测定仪（Multi Myograph System-610M）丹麦 DMT 公司；Powerlab生物信号采集处理系统澳大利亚埃德仪器国际贸易有限公司。

离体冠状动脉环的制备: SD大鼠脱臼处死后，立即取出心脏，浸入4℃，pH= 7.38 的 HEPES 液中。钝性分离大鼠冠状动脉，在前降支处剪取 2 mm 的血管环。将分离干净的冠状动脉环穿入两根直径为40 µm 的钨丝，然后将血管环固定在血管张力测定仪浴槽内传感器上。浴槽内持续通以 95 % O2和 5% CO2的混合气体，温度恒定为 37℃。动脉环平衡 90 min 后开始实验，平衡期间每隔 15～20 min 更换浴槽内 HEPES 一次。冠状动脉环的张力变化通过 DMT的换能系统采集，并用 Chart5.5记录在计算机上。

血管环活性检测: 冠状动脉环在 HEPES 液内平衡 90 min 后，用 60 mmol/L KCl 收缩动脉环 3 次，当 3次的收缩幅度相差不超过 10% 时，则认为冠状动脉环反应良好。选取收缩张力达到 2 mN以上并且收缩平台稳定的血管环进行zacopride舒张实验的研究。

冠状动脉环的去内皮: 用 10-6mol/L PE 预收缩反应良好的冠状动脉环，收缩稳定后加入10-5mol/L Ach 检验血管内皮的完整性，若加Ach 后使 PE 预收缩的血管舒张大于 90%，认为内皮完整（+Endo）；用比冠状动脉内径稍细的细管插入冠状动脉内，然后向其内温和的打入气泡，连续几次后，即可将冠状动脉内皮机械性地去除掉[10]，随后用 10-6mol/L PE 预收缩，再加入10-5mol/L Ach，当 Ach 不产生舒张作用或舒张幅度小于预收缩的 10%时，认为已完全去除内皮（-Endo）。

Zacopride 对 KCl 或 U46619 预收缩冠状动脉环的舒张作用：SD大鼠随机分为4组：+Endo（vehicle）组、+Endo（zacopride）组、-Endo（vehicle）组和-Endo（zacopride）组，每组6只大鼠。用 60 mmol/L KCl 或10-6mol/L U46619（浴槽内终浓度）预收缩每组大鼠冠状动脉环达平台后，采用累积加药的方法，+Endo（zacopride）和-Endo（zacopride）组依次加入不同浓度的 zacopride（10-6，10-5.5、10-5、10-4.5、10-4mol/L）舒张冠状动脉环，当前一浓度舒张血管达平台后再加入后一浓度，+Endo(vehicle)和-Endo（vehicle）组分别加入与zacopride等容量等摩尔浓度的 NaCl。以60 mmol/L KCl 或10-6mol/L U46619 所致冠状动脉环收缩的最大幅度为 100%，计算各个浓度 zacopride对冠状动脉环的舒张百分比。

钾通道阻断剂和一氧化氮合酶抑制剂对zacopride 舒张大鼠冠状动脉环作用的影响：实验分为 6 组，设对照组，每组 6 只大鼠，用 60 mmol/L KCl 或 10-6mol/L U46619 预收缩内皮完整冠状动脉环达平台后，分别加入钙激活钾通道（KCa）阻断剂TEA（10-2mol/L）为TEA+zacopride组、IK1阻断剂 BaCl2（10-4mol/L）为BaCl2+zacopride组、三磷酸腺苷敏感性钾通道（KATP）阻断剂 Glib（10-5mol/L）为Glib+zacopride组、电压依赖性钾通道（KV）阻断剂 4-AP（10-3mol/L）为4-AP+zacopride组及一氧化氮合酶抑制剂 L-NAME（10-4mol/L）为L-NAME+zacopride组，对照组加入等容量等摩尔浓度的NaCl。孵育约 10 min 后冠状动脉环再达平台，各组累积加入浓度梯度的 zacopride（10-6，

10-5.5、10-5、10-4.5、10-4mol/L），以 60 mmol /L KCl或 10-6mol/L U46619 收缩达平台时的最大收缩幅度为100%，计算不同作用类药物在各个浓度 zacopride 对冠状动脉环的舒张百分比数。

2　结果

不同浓度zacopride对大鼠冠状动脉环发生浓度依赖性的舒张作用（表1）：在+Endo（zacopride）组和-Endo（zacopride）组，zacopride 对 60 mmol/L KCl 和10-6mol/L U46619 预收缩大鼠冠状动脉环的最大舒张幅度分别为（90.15±6.38） % 、（81.67±4.97）%及（85.48±5.04）%、（79.65±3.51）%，均显著高于对应的+Endo（vehicle）组和-Endo（vehicle）组（P均＜ 0.05）。+Endo（zacopride）组和-Endo（zacopride）组之间对 60 mmol/L KCl 和 10-6mol/L U46619预收缩大鼠冠状动脉环的最大舒张幅度差异没有统计学意义（P＞0.05）。

钾通道阻断剂和一氧化氮合酶抑制剂对zacopride 舒张大鼠冠状动脉环的干预作用（表2）：在60 mmol/L KCl 或 10-6mol/L U46619 预收缩的内皮完整冠状动脉环上，BaCl2+zacopride组（10-4.5～10-4mol/L）对 KCl 、U46619预收缩冠状动脉环的最大舒张幅度均明显低于其对照组（P均＜0.05），差异有统计学意义。4-AP、TEA、Glib 和 L-NAME 均没有显著影响zacopride 对冠状动脉环的舒张作用（P＞0.05）。

表1　不同浓度zacopride 对 KCl 、U46619预收缩冠状动脉环的舒张百分比（%，

注：U46619：血管收缩剂血栓素A2类似物；zacopride：扎考比利； +Endo(Vehicle)组：内皮完整对照组；-Endo(Vehicle)组：去内皮对照组；+Endo (zacopride)组：内皮完整扎考比利组；-Endo (zacopride)组：去内皮扎考比利组。与+Endo(vehicle)组相比*P＜0.05；与-Endo(vehicle)组比△P＜ 0.05

表2　四组中各药物在不同浓度 zacopride 舒张KCl、 U46619预收缩冠状动脉环中的作用舒张百分比

注：TEA：四乙胺；Glib：格列苯脲； 4-AP：4-氨基吡啶；L-NAME：左旋硝基精氨酸甲酯。与对照组相比*P＜0.05。余注见表1

3　讨论

在 IK1激动剂的研究中发现，氟卡尼，吗啡和一氧化氮（NO）等药物有增强 IK1的作用，但都表现为非特异性[11，12]。本课题组前期研究发现并证实了首个IK1选择性激动剂 zacopride，其对大鼠心室肌IK1表现出特异性的激动作用，其对大鼠心室肌 IK1的内向电流和外向电流都有增强效应，而对 L-型Ca电流（ICa-L）、钠电流（INa）、钠钙交换电流（INa/Ca）、持续外向延迟整流钾电流（Isus）、瞬时外向钾电流（Ito）和钠钾泵电流（Ipump）等其它影响动作电位的主要离子电流均无显著作用[7]。构成 IK1通道的亚单位主要来自 Kir2 亚家族（Kir2.x）中的 Kir2.1、Kir2.2和 Kir2.3，Wang 等[13]的研究发现，Kir2.1通道是IK1的主要亚型，所介导的电流占总 IK1电流的80%以上。我们的研究进一步发现，zacopride对大鼠心肌IK1的激动作用是经 Kir2.1介导的, 而与 Kir2.2 和Kir2.3无关[14]。研究发现，在血管平滑肌上 IK1亚基主要是 Kir2.1的表达，无 Kir2.2 和 Kir2.3 的表达[15]，这提示我们 zacopride 可能通过激动血管平滑肌上的IK1来发挥舒张冠状动脉的作用，这是本研究的主要目标。

本研究结果表明，无论离体动脉环的内皮是否完整，zacopride都可以浓度依赖性地舒张由KCl和U46619预收缩的大鼠冠状动脉，并且L-NAME没有影响zacopride的舒张血管作用，说明zacopride的舒张血管作用是不依赖于血管内皮的，这提示zacopride可能直接作用于血管平滑肌而使冠状动脉舒张。而钾通道是选择性允许 K+跨膜通过的离子通道，在调节血管平滑肌舒缩活动中具有重要作用。激活血管平滑肌上的钾通道，能引起细胞膜超级化，从而抑制细胞外钙内流，引起平滑肌舒张[16]。血管平滑肌细胞上主要表达四种类型的钾通道： KCa、IK1、KATP和KV，本实验观察到，IK1激动剂zacopride浓度依赖性地舒张大鼠冠状动脉环，并且IK1阻断剂BaCl2明显减弱zacopride的舒张血管作用，而KCa阻断剂TEA、KATP阻断剂Glib和KV阻断剂4-AP对zacopride的舒张血管作用没有明显影响，这进一步证实了zacopride对IK1的选择性激动作用，并且可以明显地舒张血管，这将为zacopride在心血管方面的开发利用提供进一步的参考价值。

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（编辑：常文静）

Effect and Mechanism of Zacopride on Vasodilatation of Isolated Coronary Arterial Rings in Experimental Rats

LIU Cheng-fang, WANG Jin, LIU Yu, HE Rong-li, ZHANG Wei-guo, NIU Long-gang, WU Bo-wei.
Department of Human Anatomy, Shanxi Medical University, Taiyuan (030001), Shanxi, China
Corresponding Author: WU Bo-wei, Email: qwaesd299@163.com

Zacopride; Coronary artery; Vasodilatation; Inwardly-rectifying potassium Channels

山西省自然科学基金（2015021177）；山西医科大学博士启动基金（03201405）；山西医科大学青年基金（Q02201205）；

山西医科大学基础医学院331培植项目（201208）

030001 山西省太原市，山西医科大学人体解剖学教研室

刘成芳讲师博士研究方向为心律失常、心血管重构 Email：ljjlcf@ @126.com 通讯作者：吴博威 Email：qwaesd299@163.com

R54

1000-3614（2015）12-1212-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2015.12.019

（2015-03-18）