多环芳烃（芘）对斜生栅藻的毒性研究

许文武，侯梅芳，潘栋宇，周建

上海应用技术学院，上海 201418

多环芳烃（芘）对斜生栅藻的毒性研究

许文武，侯梅芳*，潘栋宇，周建

上海应用技术学院，上海 201418

多环芳烃是自然界中常见的有机污染物。以多环芳烃（芘）为研究对象，采用实验室培养斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）的方法，测定藻细胞密度和光合色素（叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素）含量的变化，研究不同质量浓度芘对斜生栅藻的毒性效应，设置5个芘质量浓度梯度（5、10、20、30、50 mg·L-1）和1个对照组，通过同期生长的处理组与对照组的藻细胞数进行比较以及抑制率计算对实验结果分析。结果表明：芘对斜生栅藻的生长有一定的抑制作用，随着芘质量浓度增加，斜生栅藻生长受到抑制作用越明显，呈现出良好时间-效应和剂量-效应的关系；经回归分析，求得2 d，4 d和6 d芘抑制斜生栅藻生长的半抑制浓度（EC50）分别为44.07，29.23和20.99 mg·L-1。斜生珊藻的生长率随处理浓度的增加而逐渐降低。同时通过肉眼和显微镜观察，发现斜生栅藻藻的颜色随芘浓度增加从翠绿色变为白色。芘处理斜生栅藻6d后，斜生栅藻光合色素含量和Ca/Cb随芘浓度增加而明显下降，并且变化趋势与生长率基本一致。其中斜生栅藻的叶绿素a含量的减少比叶绿素b和类胡萝卜素快。芘可能通过抑制藻的光合作用产生毒害效应，从而抑制藻类生长。

芘；斜生栅藻；急性毒性；光合色素；回归分析

多环芳烃（PAHs）是由两个或两个以上苯环以线状、角状或簇状排列组合成的一类中性或非极性有机化合物，它是煤、石油、烟草等有机物不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物（孙铁珩等，2005；Liu et al.，2007）。因其具有致癌、致畸、致突变作用及生物难降解性而受到广泛重视（万寅婧等，2005；姜永海等，2009）。1979年，16种多环芳烃被美国环保局（EPA）列为优先有机污染物（刘建武等，2002）。随着现代工业和农业的迅速发展，我国湖泊普遍存在PAHs污染，且污染程度逐年呈上升趋势（谢武明等，2004；Gao et al.，2007a；Zhu et al.，2008）。

藻类作为水生生态系统的主要初级生产者，对维持整个生态系统的平衡和稳定起着十分关键的作用，因而成为监测评价水环境质量的重要指标（邓惜汝等，2014）。斜生栅藻是一种极为常见的浮游植物，易获得、个体小、繁殖快且对毒物敏感，并能从水相中吸收有毒物质通过食物链将其转移到上一级生物体中（Parr et al.，2002；Ma et al.，2002；Yu et al.，2014；杨弯弯等，2013），且急性毒性试验在短期内可以获得毒性数据。斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）是一种很好的受试生物，因此本实验选择斜生栅藻作为研究对象，以湖泊水中PAHs浓度较高的芘为PAHs代表污染物，探讨芘对斜生栅藻生长的影响，为制定芘等PAHs相关的环境标准提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

芘（Pyrene），购自国药集团化学有限公司。

斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）购自中国科学院水生生物研究所，藻液用HB-4培养基培养。

1.2 实验用液的制备

HB-4培养基主要成分：(NH4)2SO42 g·L-1，K2HPO40.15 g·L-1，CaCl20.15 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.8 g·L-1，NaHCO31 g·L-1，KCl 0.25 g·L-1，FeCl31.5 mL·L-1和土壤浸提液20 mL。

土壤浸提液的制备：采取天然未污染土壤500 g，加蒸馏水1000 mL后搅匀，浸泡1 d，100 ℃水浴锅加热2 h，上清液过滤，灭菌，冷藏，保存。

1.3 驯化培养

实验前一周，斜生栅藻于培养箱中进行扩大培养，培养条件为：温度(24±2) ℃，光照强度4000 lx，光暗比12 h∶12 h，每天摇动培养瓶3～5次，使藻类生长进入对数生长期。在整个培养过程，各操作步骤均经过灭菌处理。

1.4 多环芳烃（芘）对斜生栅藻的毒性作用

将芘溶于丙酮配置成一定质量浓度的母液，丙酮作为助溶剂。根据预实验结果，设置芘对斜生栅藻的急性毒性试验的质量浓度梯度为 5、10、20、30和 50 mg·L-1，用培养基进行稀释，现用现配。取对数生长期的斜生栅藻加入100 mL的锥形瓶中，再加入培养基稀释已配置的芘母液到所需质量浓度，每个锥形瓶的培养藻液体积为50 mL，使各藻类的起始密度为6×105cells·mL-1左右，每组设3个重复，另各设未含芘培养的藻液作对照，将藻液放入上述条件下进行培养，实验周期为6 d。每隔48 h取藻液采用血球计数板计数，测定藻细胞密度（cells·mL-1）和650 nm波长处的光密度值。

1.5 指标测定

1.5.1 芘对斜生栅藻EC50的测定

每隔48 h取藻液采用血球计数板计数，测定藻细胞密度（cells·mL-1），连续测定 6 d。用概率单位-质量浓度法计算出6 d半抑制效应浓度（EC50）。计算过程如下（许文武等，2011）：

抑制率(%)=(μck-μtox/μck)×100%

式中：μck为对照组藻的生长量（cells·mL-1），μtox为有共试化合物生长量（cells·mL-1）。

平均比生长速率（μ）计算公式为：μ=(lnNn-lnN1)/(tn-t1)

式中：N1为 t1时的藻细胞数（cells·mL-1），Nn为tn时的藻细胞数（cells·mL-1）。

根据芘对藻抑制率的概率单位和相应的质量浓度，用直线回归法得到质量浓度效应方程，计算出半效应浓度EC50（mg·L-1）。

1.5.2 芘对斜生栅藻光合色素含量影响的测定

培养第6天，取各浓度组10 mL藻液，4000 r·min-1离心10 min，取上清液；加入5 mL体积分数80%（V/V）丙酮，摇匀，在4 ℃冰箱中避光抽提24 h；再10000 r·min-1离心10 min，取上清液置于1 cm石英比色杯中，以80%丙酮为参比，于721型分光光度计中测量663、645和470 nm波长处抽提液的吸光度值。叶绿素含量计算过程如下（戴荣继等，2004）：

式中：Ca为叶绿素a含量（mg·L-1）；Cb为叶绿素 b含量（mg·L-1）；Ck为类胡萝卜素含量（mg·L-1）。

1.6 数据分析

实验数据用Origin 8.0作图分析和SPSS V17.0软件包进行独立样本进行方差分析，P<0.05为显著性差异，P<0.01为极显著性差异，计算出EC50的95%置信限。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度的多环芳烃（芘）对斜生栅藻生长的影响

用不同质量浓度（5、10、20、30和50 mg·L-1）多环芳烃（芘）分别处理藻液，斜生栅藻的生长曲线发生改变见图1。由图1可以看出，加了芘的各实验组中，藻细胞生长受到不同程度的抑制，低质量浓度（0～10 mg·L-1）的芘对藻细胞生长影响不大，高质量浓度（20～50 mg·L-1）组细胞的生长从第 2天开始就受到较强的抑制，细胞的死亡速度大于生长速度，藻细胞密度逐渐降低。随着芘处理时间的延长，抑制作用越强。从表1也可以看出，斜生栅藻对照组中的比增长率一直是正值，说明藻的生长符合生长状况。实验组中只有两组低质量浓度（5和10 mg·L-1）处理的比增长率是正值外，其他几组均有负值出现，说明藻是呈负增长的，并呈现出良好时间-效应和剂量-效应的关系。

图1 不同芘质量浓度（mg·L-1）对斜生栅藻的生长曲线Fig. 1 Growth curve of S. obliquus in different mass concentration (mg·L-1) of pyrene

根据图1的生长结果，用上述方法得到不同时间的概率单位-质量浓度直线方程：概率单位(y)=b×质量浓度(x)+a，当概率单位为 5时，计算出 EC50值（见表2）。由表2可知，芘对斜生栅藻2、4和6 d的EC50分别为44.07、29.23和20.99 mg·L-1，观察各个时间段的EC50值，第6天最敏感，其值最小。本研究结果表明EC50随着暴露天数的延长，斜生栅藻对芘的抗性逐渐降低，藻细胞恢复速度缓慢。关于多环芳烃对藻类的毒性作用研究，先前已有报道，如Okay et al.（2002）研究表明芘对三角褐指藻的EC50为70～80 μg·L-1；李艳梅等（2012）研究指出低质量浓度萘对三角褐指藻生长的抑制作用不明显，但当萘质量浓度达到8 mg·L-1时，藻细胞受抑制程度随着萘质量浓度的升高而增大；王秀翠等（2014）以铜绿微囊藻为试验对象，研究了萘、菲和芘对其生长的影响，发现萘质量浓度大于4.05 mg·L-1时，铜绿微囊藻生长有显著的抑制作用，菲质量浓度达到3.28 mg·L-1时，铜绿微囊藻的生长完全受到抑制，而芘质量浓度在 0.15～8 mg·L-1之间时，铜绿微囊藻的生长抑制作用并不明显，由此可以看出，芘对藻的敏感性要小于萘和菲；江晶（2010）研究了萘对斜生栅藻的生长影响，结果表明其EC50值为13.34 mg·L-1（4 d）；Djomo et al.（2004）研究表明苯并(a)芘、萘、蒽和菲对淡水藻7 d后的 EC50分别为 1.28～72 μg·L-1、54.32～102.90 μg·L-1、0.74～1.50 mg·L-1和34.88～72.50 mg·L-1；张朝等（1999）研究发现1-硝基芘对斜生栅藻的EC50为0.1824 mg·L-1（4 d）。综上可知，不同的多环芳烃对于不同的藻类毒性存在很大差异，可能源于多环芳烃对藻类很多关键代谢活动产生不同的影响；藻类对多环芳烃的敏感性差异主要与藻的种类以及多环芳烃化学式不同有关（Singh et al.，2006）。在本研究中，这一实验结果较其它多环芳烃对斜生栅藻的EC50值偏高，说明斜生栅藻对芘具有较低的敏感性或芘对斜生栅藻具有较低的毒性。

表1 斜生栅藻各处理组的比增长率的分析Table 1 The analysis of specific growth rate of S. obliquus

表2 毒性试验的回归方程、EC50(mg·L-1)和95%置信限Table 2 Regression equation, EC50values (mg·L-1) and 95% confidence limits of toxicity

2.2 多环芳烃(芘)对斜生栅藻光合色素的影响

光合色素是植物进行光合作用的物质基础，可以判断植物光合生理能力的依据，色素含量变化也能较好地反映植物各阶段的生长发育是否正常（杨慧丽等，2010）。斜生栅藻被芘胁迫 6 d后，对叶绿素a, b及类胡萝卜素的含量进行测定，结果见表3。

表3 芘质量浓度对斜生栅藻光合色素的影响（mg·L-1）Table 3 Effect of mass concentration (mg·L-1) of pyrene on the pigment in S. obliquus

由表 3可以看出，随着芘质量浓度（0～50 mg·L-1）增加，各种光合色素以及Ca/Cb均呈下降趋势，在各种光合色素中叶绿素a受到影响最大。Qin et al.（2012）在研究恩诺沙星对斜生栅藻的毒性机制过程中表明，随着恩诺沙星浓度的增加，斜生栅藻各种光合色素以及 Ca/Cb均呈不同程度的下降趋势。洪华嫦等（2003）在研究五氯酚对斜生栅藻的毒性效应时指出，总的光合色素随五氯酚浓度的增加而减少，这与本研究结果相一致。引起光合色素下降可能是因为芘胁迫条件下引起叶绿体膨胀破裂，类囊体膜解体，叶绿体从组织中流失（Gao et al.，2007b）；也可能是因为芘进入藻细胞内部产生活性氧，细胞内活性氧的积累，使藻细胞叶绿体结构受到损伤，叶绿素合成受阻（Geoffroy et al.，2003；Gurbuz et al.，2009）。光合色素下降势必会直接影响光合作用的正常进行，进而影响到藻细胞体内其它有机物质（如各种蛋白质）的合成（刘涛等，2006）。在本研究中，通过肉眼和显微镜观察到藻细胞颜色随着芘浓度增加由翠绿色逐渐变成淡绿色，高浓度组变为白色。

3 结论

（1）被芘胁迫后，在低质量浓度组（5和 10 mg·L-1）中斜生栅藻生长速率与对照组相比有限制作用。在较高质量浓度（>10 mg·L-1）时，表现明显的抑制作用，芘质量浓度继续增大达到50 mg·L-1时，其对斜生栅藻的毒性效应会导致其完全停止生长，呈现出良好时间-效应和剂量-效应的关系，其对斜生栅藻的6d-EC50为20.99 mg·L-1。

（2）多环芳烃（芘）浓度对斜生栅藻的各种光合色素均有较大的影响。随着芘质量浓度（0～50 mg·L-1）的增加，各种光合色素的含量和Ca/Cb均呈下降趋势，并且变化趋势与生长率基本一致，说明藻细胞在芘的胁迫作用下，叶绿素结构受到损害。由于多环芳烃在世界范围内的广泛存在，进入水体后，必将对藻的生存、生长、繁殖带来一定的影响，继而危害整个水生态系统。本研究对于了解多环芳烃对单种藻类的毒性效应以及评价其生态风险是很重要的。

DJOMO J E, DAUTA A, FERRIER V. 2004. Toxic effects of some major polyaromatic hydrocarbons found in crude oil and aquatic sediments on Scenedesmus subspicatus [J]. Water Research, 38(7): 1817-1821.

GAO J, SUN M Z, WANG Q Y. 2007a. Effects of copper ion on the growth of Isochrysis zhanjiangensis [J]. Marine Fisheries Research, 28(4): 54-58.

GAO Y Z, XIONG W, LING W T, et al. 2007b. Impact of exotic and inherent dissolved organic matter on phenanthrene sorption by soils [J]. Journal of Hazardous Materials, 140(1-2): 138-144.

GEOFFROY L, DEWEZ D, VERNET G, et al. 2003. Different physiological parameters used in evaluation of oxyfluorfen effect on S.obliquus: validity of parameters as biomarkers [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology, 45(4): 439-454.

GURBUZ F, CIFTCI H, AKCIL A. 2009. Biodegradation of cyanide containing effluents by Scenedesmus obliquus [J]. Journal of Hazardous Materials, 162(1): 74-79.

LIU L, TINDALL J A, FRIEDEL M J. 2007. Biodegradation of PAHs and PCBs in soils and sludges [J]. Water, Air and Soil Pollution, 181(5): 281-296.

MA J, ZHENG R, XU L, et al. 2002. Differential sensitivity of two green alga, Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa to 12 pesticides [J]. Ecotoxicol Environ Saf, 52(1): 57-61.

OKAY O S, TÜFEKCI V, DONKIN P. 2002. Acute and Chronic Toxicity of

Pyrene to the Unicellular Marine Alga Phaeodactylum tricornutum [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 68(4): 600-605.

PARR L B, PERKINS R G, MASON C F. 2002. Reduction in photosynthesis efficiency of Chladophora glomerata induced by overlying canopies of Lemna sp. [J]. Water Research, 36(7): 1735-1742.

QIN H W, CHEN L F, LU N, et al. 2012. Toxic effects of enrofloxacin on Scenedesmus obliquus [J]. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 6(1): 107-116.

SINGH S, DATTA P. 2006. Screening and selection of most potent diazotrophic cyanobacterial isolate exhibiting natural tolerance to rice field herbicides for exploitation as biofertilizer [J]. Journal of Basic Microbiology, 46(3): 219-225.

YU X, ZUO J, TANG X, et al. 2014. Toxicity evaluation of pharmaceutical wastewaters using the alga Scenedesmus obliquus and the bacterium Vibrio fischeri [J]. Journal of Hazardous Materials, 266: 68-74.

ZHU L Z, CHEN Y Y, ZHOU R B. 2008. Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in water, sediment and soil in drinking water resource of Zhejiang Province, China [J]. Journal of Hazardous Materials, 150(2): 308-316.

戴荣继, 黄春, 佟斌, 等. 2004. 藻类叶绿素及其降解产物的测定方法[J].中央民族大学学报:自然科学版, 13(1): 75-80.

邓惜汝, 鲜啟鸣, 孙成, 等. 2014. 毒死蜱对淡水藻类毒性效应的比较研究[J]. 生态环境学报, 23(3): 472-476.

洪华嫦, 周海云, 蓝崇钰. 2003. 五氯酚对斜生栅藻的毒性效应研究[J].环境科学研究, 16(6): 23-28.

江晶. 2010. 萘对斜生栅藻和铜绿微囊藻毒性效应研究[D]. 长春: 东北师范大学: 14.

姜永海, 韦尚正, 席北斗, 等. 2009. PAHs在我国土壤中的污染现状及其研究进展[J]. 生态环境学报, 18(3): 1176-1181.

李艳梅, 曾文炉, 余强, 等. 2012. 萘对海洋三角褐指藻生长的毒性效应及生化指标研究[J]. 中国环境科学, 32(1): 150-155.

刘建武, 林逢凯, 王郁, 等. 2002. 多环芳烃(萘)污染对水生植物生理指标的影响[J]. 华东理工大学学报, 28(5): 520-524.

刘涛, 熊丽, 生秀梅, 等. 2006. 高效氯氰菊酯对斜生栅藻的毒性研究[J].化学与生物工程, 23(7): 37-39.

孙铁珩, 李培军, 周启星, 等. 2005. 土壤污染形成机理与修复技术[M ].北京: 科学出版社, 23.

万寅婧, 占新华, 周立祥. 2005. 土壤中芘、菲、萘、苯对小麦的生态毒性影响[J]. 中国环境科学, 25(5): 563-566

王秀翠, 高彦征, 朱雪竹, 等. 2014. 萘、菲和芘对铜绿微囊藻生长的影响[J]. 农业环境科学学报, 33(4): 56-663.

谢武明, 胡勇有, 刘焕彬, 等. 2004. 持久性有机污染物(POPs)的环境问题与研究进展[J]. 中国环境监测, 20(2): 58-61.

许文武, 孟菁, 胡威, 等. 2011. 5种酚类化合物对3种水生生物的毒性作用[J]. 环境化学, 30(10): 1751-1757.

杨慧丽, 段舜山. 2010. 邻苯二甲酸二丁酯对三角褐指藻的生态毒性效应[J]. 生态环境学报, 19(9): 2155-2159.

杨弯弯, 武氏秋贤, 吴亦潇, 等. 2013. 恩诺沙星和硫氰酸红霉素对铜绿微囊藻的毒性研究[J]. 中国环境科学, 33(10): 1829-1834.

张朝, 竺乃恺, 夏希娟, 等. 1999. 1-硝基芘与苯衍生物共存对斜生栅藻的联合毒性[J]. 环境化学, 18(1): 87-91.

Study on the Toxicity of PAHs (pyrene) to Scenedesmus Obliquus

XU Wenwu, HOU Meifang*, PAN Dongyu, ZHOU Jian
Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are common contaminants in nature. In this study, a laboratory culture was conducted to examine the toxicity effects of pyrene under different mass concentrations on the growth and the contents of pigments of Scenedesmus obliquus. The exposure mass concentrations of pyrene were 0, 5, 10, 20, 30, 50 mg·L-1. Comparing the numbers of the cells of the treatment with that of the control group at the same time, the data were analysed by the calculating of IR so on. The results showed that the growth of algae was inhibited by pyrene and decreased with the increase of pyrene mass concentration, exhibiting a good time-effect and concentration-effect manners. The 2 d, 4 d and 6 d-EC50of Scenedesmus obliquus were 44.07, 29.23 and 20.99 mg·L-1respectively by regression analysis, The algae growth rates decreased with the increasing of pyrene mass concentration. It can be seen that the color of algal cells changed from green to white. Meanwhile, the contents of the pigments were examined. The total content of pigments and the ratio between chlorophyll a and chlorophyll b decreased significantly with the increasing of pyrene mass concentration and the trends of change were coincident with their specific growth rate. The experimental results indicated that chlorophyll a contents of Scenedesmus obliquus reduced faster than those of chlorophyll b and carotenoid. The ecotoxic effects of pyrene might be ascribed to the inhibition of the algal photosynthesis by pyrene.

pyrene; Scenedesmus Obliquus; acute toxicity; pigments; regression analysis

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.08.016

X171.5

A

1674-5906（2015）08-1361-05

许文武，侯梅芳，潘栋宇，周建. 多环芳烃（芘）对斜生栅藻的毒性研究[J]. 生态环境学报, 2015, 24(8): 1361-1365.

XU Wenwu, HOU Meifang, PAN Dongyu, ZHOU Jian. Study on the Toxicity of PAHs (pyrene) to Scenedesmus Obliquus [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(8): 1361-1365.

国家自然科学基金项目（41171250；20907011）；上海应用技术学院引进人才基金项目（YJ2013-16）

许文武（1986年生），男，硕士研究生，研究方向为土壤及水环境修复。E-mail: xuwenwu423@126.com *通信作者。E-mail: mfhou@sit.edu.cn

2015-03-31