EDTA和柠檬酸对反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)Cu迁移富集影响研究

2015-12-07刘婕朱宇恩刘娜王翠红吴山

生态环境学报 2015年8期

刘婕，朱宇恩,，刘娜，王翠红，吴山

1. 山西大学环境与资源学院，山西太原 030006；2. 山西省土壤环境与养分资源重点实验室，山西太原 030006；3. 广东省生态环境与土壤研究所，广东省农业环境综合治理重点实验室，广东广州 510650

刘婕1，朱宇恩1,2*，刘娜1，王翠红1，吴山3

为明确反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)对Cu的富集能力及EDTA与柠檬酸（CA）对Cu迁移的影响，采用盆栽试验，在0、100、200、400、800 mg·kg-1Cu处理质量分数及2.5 mmol·kg-1EDTA和柠檬酸施加条件下，测定了根际土、非根际土Cu不同形态含量及反枝苋组织Cu富集特征。结果表明：Cu处理质量分数小于400 mg·kg-1时，重金属Cu组织富集特征为根>叶>茎，Cu处理质量分数在400 mg·kg-1时，富集特征为根>茎>叶，Cu各处理组BCF与TF均小于1，不具备Cu超富集植物特征；EDTA、柠檬酸均可促进反枝苋对土壤中Cu的富集，并强化Cu由根系向地上部分的转移。EDTA的促进作用远高于柠檬酸，在Cu 800 mg·kg-1，施EDTA处理组反枝苋地上部分Cu可达3 513 mg·kg-1。施加EDTA可增加根际土全Cu含量，显著减少根际土中Fe-Mn态Cu含量，增加Exch态，促使Fe-Mn态向Exch态的转化；柠檬酸处理的根际土中则以Fe-Mn态向Carb态转化为主。由此可见，在EDTA强化修复下，反枝苋富集Cu的能力明显增加，而根际土中Cu全量的增加，是Cu-EDTA迁移活性极大增加与反枝苋防御性Cu阻隔共同作用的结果。

Cu；反枝苋；EDTA；柠檬酸；富集；迁移；植物修复

Cu是植物生长的必须元素，在一定浓度范围对植物生长有促进作用，过多则具有重金属毒害效应，对植物生长发育产生影响，进而通过富集作用影响人类健康（陈贵英等，2012；Zhang et al.，2010）。目前 Cu已经成为土壤重金属主要污染元素之一（Bolan et al.，2014；姜理英等，2003）。因此，近年来对土壤Cu污染修复研究正逐步展开，而植物修复技术作为一种原位修复技术具有低成本、风险可控及环境友好的特点，被广泛应用于土壤重金属污染修复（Burken et al.，2014；Ali et al.，2013）。同时利用EDTA、EDDS、NTA、CA等螯合剂强化修复也成为一种增强修复效果的常用措施（Abbas et al.，2013）。

反枝苋（Amaranthus retroflexus L.）属于双子叶植物纲（Dicotyledoneae）苋科（Amaranthaceae），在我国多数区域特别在北方地区分布广泛，是一种常见的田间杂草（鲁萍等，2010），具有生长快且生物量大的特点，可作为生物修复资源加以发掘。关于苋科植物修复土壤重金属的研究已有报道，Río et al.（2002）发现北美苋（Amaranthus blitoides）在调研物种中是富集重金属能力最强的植物。Chunilall et al.（2005）和Tripathi et al.（1997）发现绿穗苋（Amaranthus hybridus）和一种红苋（Amaranthus dubius）对重金属Cd有很强的富集能力；反枝苋修复硼污染土壤的潜力也有报道（Santos et al.，2010；Aydin et al.，2009）。反枝苋作为C4植物，具有光合作用强、生长速度快、重金属耐性强、适种范围广等特点，可作为污染土壤植物修复的备选植物。

基于此，本文采用盆栽试验，在不同Cu质量分数梯度和不同螯合剂EDTA、柠檬酸施加情况下，从生物量、组织富集迁移差异、根际土Cu赋存特征展开研究，尝试揭示反枝苋对重金属Cu耐性及运移特征与EDTA、柠檬酸螯合剂对反枝苋Cu迁移能力的影响规律，探究反枝苋Cu富集特征并验证反枝苋应用于Cu污染土壤植物修复的可能性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试土壤来自山西省太原市郊区农田石灰性褐土，土壤理化性质见表1。供试植物为反枝苋。

表1 供试土壤理化性状Table 1 The physical and chemical properties of soil

1.2 实验设计与实施

采集土壤经阴干后过2 mm尼龙筛，取2 kg装入聚氯乙烯塑料盆中，一次性施入基肥，以磷酸二氢钾（KH2PO4）、尿素形式加入土壤中充分混匀（N：100 mg·kg-1；P：50 mg·kg-1；K：50 mg·kg-1）。实验设计5个不同Cu质量分数梯度，分别为0、100、200、400、800 mg·kg-1，每个处理设3个重复。将分析纯CuSO4.5H2O按所设计的浓度配成母液，逐级稀释成处理浓度，与对应盆土充分混合均匀后，稳定四周。选择籽粒饱满的反枝苋种子，每盆均匀撒播种子后上覆2 cm供试土壤。试验期间（2014.6.6至2014.9.12共15周），保持室外温度及自然光照，土壤水分维持在田间持水量的60%。出苗后间苗，保持每盆10株；播种后第10周分为3组处理，分别是：（1）Cu处理组：不添加EDTA、柠檬酸；（2）Cu+EDTA处理组：施加2.5 mmol·kg-1EDTA（Seydahmet et al.，2015；Yang et al.，2012）；（3）Cu+柠檬酸处理组：施加2.5 mmol·kg-1柠檬酸（Zhuo et al.，2015）。其中EDTA与柠檬酸均以溶液形式一次性加入盆栽中；每个处理均为3个重复。处理5周后收获植株，测定鲜质量，对反枝苋的相关指标进行试验分析。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤理化性质

参照中国土壤学会编的土壤农业化学分析方法（鲁如坤等，2000）。

1.3.2 反枝苋生物量测定

将植物洗净晾干，用剪刀从根部剪开，在电子天平上分别称量地上部分和地下部分鲜质量（g）。

1.3.3 根际土、非根际土全Cu含量测定

采用抖根法收集反枝苋根部粘附2 mm土壤，经风干后过100目筛备用。取土样0.1000 g于聚四氟乙烯消解罐中，加入1 mL HF、2 mL HNO3、1 mL HClO4，160 ℃高压消解3 h，赶酸后用10% HNO3定容过滤。用ICP-AES测定Cu含量。取土壤标准物质（GBW 07401(GSS-1)）对试验数据进行质量控制。

1.3.4 反枝苋植物中Cu含量测定

将收获后的植株依次使用自来水、去离子水、超纯水冲洗干净，按照根、茎、叶3部分分离，于105 ℃下杀青30 min，60 ℃下烘干至恒重。将反枝苋根、茎、叶分别破碎研磨，并过0.1 mm筛，干燥保存。

准确称取植物样品0.2000 g于聚四氟乙烯消解罐中，加入1 mL 30% H2O2、2 mL HNO3，静置2 h后于160 ℃高压消解3 h，将消解后的样品用超纯水定容过滤。用ICP-AES测定Cu含量。地上部分Cu含量按照叶：茎质量比1∶3（鲜质量称量后取均值）权重计算。取菠菜标准物质（GBW10015(GSB-6)）对试验数据进行质量控制。

1.3.5 土壤分形态含量测定

采用 Tessier法对土壤分形态含量进行测定（Tessier et al.，1979）。

1.4 统计分析

使用Microsoft Excel 2007、SPSS 18.0和Origin 8.5软件对数据进行处理分析并做图。

2 结果与分析

2.1 EDTA和柠檬酸对不同Cu质量分数条件下反枝苋生长的影响

如图1，随着Cu添加量的增加，反枝苋的地上部分鲜质量先增加然后逐渐降低；在施加 2.5 mmol·kg-1EDTA和2.5 mmol·kg-1柠檬酸的条件下，反枝苋地上部分鲜质量也表现为先增加再降低的趋势。在Cu添加量为200 mg·kg-1时，Cu+柠檬酸处理组地上部分鲜质量分别为 Cu处理组、Cu+EDTA处理组的1.7、1.9倍；在Cu添加量为400 mg·kg-1时，Cu+柠檬酸处理组地上部分鲜质量分别为 Cu处理组、Cu+EDTA处理组的 2.2、4.4倍，均达显著性差异水平（P<0.5）。

高浓度Cu对反枝苋地下部分的生长表现为抑制作用。地下部分鲜质量随Cu添加量的变化趋势基本与地上部分鲜质量相同，且在Cu质量分数为800 mg·kg-1时，Cu+柠檬酸处理组地下部分鲜质量分别为Cu处理组、Cu+EDTA处理组的1.8和3.0倍，达显著性差异水平。

图1 EDTA和柠檬酸对反枝苋地上部分及地下部分鲜质量的影响（n=3）Fig. 1 The effects of EDTA and CA on fresh biomass of shoots and roots of A. retroflexus

2.2 EDTA和柠檬酸对反枝苋根、茎、叶及地上部分Cu含量的影响

2.2.1 反枝苋不同组织对Cu的富集效应

如表2所示，Cu主要积累在反枝苋的根部。当外源Cu添加量低于400 mg·kg-1，Cu含量由高到低依次为根>叶>茎；当外源Cu添加量为400 mg·kg-1，Cu含量由高到低依次为根>茎>叶。随着外源Cu质量分数的升高，反枝苋根、茎和叶中Cu含量均逐渐升高。由于Cu添加量为800 mg·kg-1时反枝苋地上部分生物量即茎和叶的量较低，因此只测定了地上部分总Cu含量。

2.2.2 EDTA和柠檬酸对反枝苋根部Cu含量的影响

3种处理条件下，反枝苋根部积累量随着 Cu添加量的升高而明显增加，如表2所示。外源 Cu添加量为0、100 mg·kg-1时，EDTA添加组反枝苋根部Cu质量分数较Cu处理组略低；外源Cu添加量为200、400、800 mg·kg-1，根部Cu质量分数显著高于Cu处理组，分别达到Cu处理组的1.5、9.4、19.5倍。在添加柠檬酸的条件下，外源Cu添加量为0、100、200、400 mg·kg-1，根部Cu质量分数较Cu处理组相差不大，未达显著性差异水平；当外源Cu添加量为800 mg·kg-1，苋体根部Cu质量分数是Cu处理组的8.0倍，达到显著性差异水平。

表2 EDTA和柠檬酸对反枝苋根、茎、叶中Cu质量分数的影响变化Table 2 The effects of EDTA and CA on copper accumulations of A.retroflexus

2.2.3 EDTA和柠檬酸对反枝苋茎、叶及地上部分Cu含量的影响

植物地上部重金属含量是判断植物提取修复效果的重要指标（刘杰等，2008）。如表 2所示，在对照组，除EDTA处理组叶Cu质量分数外，各处理茎、叶Cu质量分数均未达显著差异。添加外源Cu后，各处理反枝苋茎、叶Cu质量分数随外源Cu添加量升高而增加，但EDTA促进效果显著优于柠檬酸处理组。Cu添加量为0、100、200、400 mg·kg-1时，EDTA处理组叶片Cu质量分数分别达到对照组的2.5、25.0、22.9、22.1倍，达显著水平；而柠檬酸处理组仅为 1.1、1.0、3.5、3.0倍，未达显著差异水平。土壤Cu质量分数大于100 mg·kg-1时，EDTA对反枝苋茎Cu影响明显，在200、400 mg·kg-1分别为对照组8.3、29.0倍，达到显著差异水平。EDTA与柠檬酸对反枝苋地上部分与茎、叶Cu质量分数影响趋势保持一致。在800 mg·kg-1Cu添加量时，两种螯合剂处理组苋体地上部分Cu质量分数分别达到对照组的61.8与26.4倍。

2.2.4 EDTA和柠檬酸对反枝苋富集系数和迁移系数的影响

植物富集重金属特征常用富集系数（BCF，Biological Concentration Factor）和转移系数（TF，Transportation Factor）表示。富集系数计算方法为植物地上部分与土壤中重金属含量的比值，富集系数越大，植物富集能力越强（Salt et al.，1995）。重金属从根部向地上部分运移能力，用迁移系数TF表示，计算方法为地上部分与根部重金属含量比值。

如表3所示，在未添加螯合剂的情况下，反枝苋对重金属Cu的BCF和TF均小于1；在添加EDTA和柠檬酸的情况下，反枝苋的BCF和TF较对照组有所增加。在Cu添加质量分数超过200 mg·kg-1时，添加EDTA使反枝苋BCF增加并大于1，达到超富集植物要求；在Cu质量分数为100 mg·kg-1时EDTA使反枝苋TF达到最大值2.84；在Cu质量分数为800 mg·kg-1时柠檬酸处理反枝苋 TF达到最大值0.97。

表3 EDTA和柠檬酸对反枝苋Cu富集及迁移系数影响Table 3 The effects of EDTA and CA on BCF and TF of A. retroflexus

2.3 EDTA和柠檬酸对根际土壤与非根际土壤Cu含量及形态的影响

2.3.1 EDTA和柠檬酸对根际土壤全Cu含量的影响

EDTA和柠檬酸可改变土壤中重金属离子的环境行为从而影响重金属含量。如图2所示，在添加柠檬酸的条件下，根际土壤全Cu含量与Cu处理组全Cu含量的无显著差别；在添加EDTA的条件下，根际土壤全Cu含量较Cu处理组明显增加。在外源Cu添加量为200 mg·kg-1，Cu+EDTA处理组的根际土壤全Cu质量分数达342. mg·kg-1，比Cu处理组和 Cu+柠檬酸处理组根际土全 Cu质量分数增加56.03%、57.05%，具有显著性差异；当外源Cu添加量为400 mg·kg-1，Cu+EDTA处理组的全Cu质量分数达529 mg·kg-1，显著高于其他两组，较Cu处理组和 Cu+柠檬酸处理组全 Cu质量分数增加25.52%、23.09%。

图2 EDTA和柠檬酸对反枝苋根际土壤与非根际土壤全Cu含量的影响Fig. 2 The effects of EDTA and CA on copper content in the rhizosphere and bulk soil of A. retroflexus

2.3.2 EDTA和柠檬酸对根际土壤与非根际土壤Cu形态的影响

如图3显示，EDTA和柠檬酸处理的根际土壤和非根际土壤中，可交换态（Exch）、碳酸盐结合态（Carb）、铁锰氧化物结合态（Fe-Mn）、有机物结合态（Orga）和残渣态（Resi）Cu含量的变化。在未添加螯合剂的条件下，根际土与非根际土 Cu形态分布无明显变化，低浓度Cu主要以Resi态为主，其次为Fe-Mn态、Orga态、Carb态，Exch态最少；随着Cu添加量的增加，Fe-Mn态占比增加，Resi态减少。在有EDTA添加条件下，根际土Exch态和Carb态明显增加，且在Cu大于100 mg·kg-1时主要以Exch态为主；而非根际土中Exch态较根际土明显降低。在添加柠檬酸条件下，促进了Resi态向Fe-Mn态与Carb态的转化，根际土和非根际土Carb态和Exch态比Cu处理组有所增加，且Carb态增加较为明显。

3 讨论

已有研究调查了苋科植物富集重金属的可行性。Adedeji早在1984年就通过沙培实验研究了Cu对假刺苋的影响，发现在0和高浓度（4、8和16 mg·L-1）Cu处理中假刺苋植株均出现萎黄病症，生物量、P、Fe元素含量下降，而1和2 mg·L-1Cu处理中植株生长旺盛（Adedeji，1984）。本实验中发现在100 mg·kg-1时，反枝苋生物量最大，而在0和高浓度（200、400、800 mg·kg-1）生物量较低，说明反枝苋生长存在Cu适生性阈值范围。Font et al.（2006）通过野外调查和盆栽实验发现北美苋地上部分在Amaranthus blitoides、Cynodon dactylon等4种植物中具有最高的 Pb、Zn积累浓度。在Aznalcóllar矿区废渣污染Guadiamar河流地区野生植物研究中，发现北美苋（Amaranthus blitoides）在所有植物中对Cu、Zn、Cd、As的吸附量均达到最大（Río et al.，2002）。Renna et al.（2015）也发现食用反枝苋易导致Cd、Pb的过量摄入，证实苋科植物具备一定的重金属耐性与富集潜力。本研究中，Cu 5种处理组无论根、茎、叶含量均未超过1000 mg·kg-1，未达到Cu超富集植物标准（Baker et al.，1989），BCF与TF也未超过1。在螯合剂EDTA和柠檬酸辅助下，Cu在反枝苋体内的富集显著增加，地上部分最高浓度达到3513 mg·kg-1。可见，反枝苋在石灰性褐土上虽不具备超富集植物的特征，但EDTA与柠檬酸辅助下有助于反枝苋在植物修复中的应用。

图3 EDTA和柠檬酸对反枝苋根际土壤与非根际土壤Cu形态的影响(n=3)Fig. 3 The effects of EDTA and CA on five speciation of copper in the rhizosphere and bulk soil

在重金属污染土壤中添加螯合剂，可为土壤中重金属离子提供配体，形成重金属-螯合剂复合物。EDTA和柠檬酸属于不同类型的螯合剂，对重金属Cu的螯合能力与稳定常数有关，EDTA与Cu有较高的稳定常数（Ks=18.80），因此EDTA与土壤中的Cu形成的复合物Cu(Ⅱ)-EDTA相对于柠檬酸与Cu形成的复合物Cu(Ⅱ)-CA更为稳定（Yuan et al.，2007），且形成的复合物可溶性较好；EDTA和柠檬酸可将土壤颗粒上吸附的重金属离子解吸溶解到土壤溶液中，使其可交换态Cu和碳酸盐结合态Cu浓度大大增加，将Cu从不易溶解的形态转化为可溶形态（Saifullah et al.，2009；Li et al.，1996），进而活化重金属Cu并增强Cu在土壤中的可迁移性及植物有效性。本研究中螯合剂EDTA对Cu的活化程度远高于柠檬酸，与Muhammad et al.（2009）的研究结论一致。EDTA络合作用强、稳定常数大，较柠檬酸不易生物降解是主要原因（Luo et al.，2005）。

植物根系对根际土理化性状影响强烈。植物作用过程主要包括植物根系对土壤溶液中金属离子的吸收以及在植物体内的转移和贮存。在EDTA和柠檬酸作用下，螯合剂可从土壤矿质上解吸金属离子并进入植物根际土中。传统观点认为，仅有自由金属离子可被根系吸收，EDTA螯合态金属难以通过质膜（Leštan et al.，2008），但研究发现，Pb-EDTA及EDDS可通过根系内表皮与凯式带破损处以及尚未形成栓皮层的细胞壁处，进入根系进而向地上部分迁移（Vassil et al.，1998；Römheld et al.，2008；Grcman et al.，2003）。此过程中，根系细胞壁对重金属的吸附、固定、阻隔作用是植物重要的防御机制（朱宇恩等，2011），但同时螯合剂的破坏及重金属高度集聚使根枯萎，富集重金属的外皮层容易脱落，与根际土融合，是根际土Cu含量升高的因素之一。另一因素是添加的EDTA与土壤中的自由重金属Cu结合，当自由重金属Cu减少时，被Fe、Mn氧化物解吸及沉淀复合物或呈固相的金属离子开始溶解，促进土壤固相中的重金属释放进入到土壤溶液中，以补偿平衡的移动，使土壤中Fe-Mn态向Exch态转化（Norvell，1984；Lestan，2015），在反枝苋蒸腾拉力和根压的推动下，Cu随着土壤溶液向反枝苋根系方向迁移到根际土壤中（Kim et al.，2010；王贺，2000）；辅以根系分泌物对重金属的吸附作用（Kim et al.，2010），最终表现为根际土中全Cu含量高于非根际土壤。

4 结论

（1）在土壤Cu添加量为0～800 mg·kg-1的条件下，Cu主要富集在反枝苋根部，且富集系数和迁移系数均小于1，不具备超富集植物的特征。

（2）EDTA、柠檬酸均可促进反枝苋对土壤中Cu的富集，并强化Cu由根系向地上部分的转移。EDTA的促进作用远高于柠檬酸。EDTA施加条件下，反枝苋地上部分最高质量分数达到 3513 mg·kg-1，可应用于反枝苋螯合强化修复技术。

（3）EDTA可显著增加200、400 mg·kg-1根际土Cu含量，柠檬酸处理组根际土Cu含量与非根际土无显著差异。

（4）Cu添加量100 mg·kg-1时，施加EDTA可显著减少根际土Fe-Mn态Cu含量，增加Exch态 Cu含量，促使Fe-Mn态向Exch态的转化；而非根际土中 Exch态较根际土显著降低。在添加柠檬酸的条件下，可促进Fe-Mn态向Carb态与Exch态的转化，其中Carb态增加较为明显。

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Effects of EDTA and Critic Acid (CA) on the Translocation and Accumulation of Copper in Amaranthus Retroflexus L. System

LIU Jie1, ZHU Yu’en1,2*, LIU Na1, WANG Cuihong1, WU Shan3
1. School of Environment and Resources, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Key Laboratory of Soil Environment and Nutrient Resources of Shanxi Province, Taiyuan 030006, China; 3. Guangdong Key Laboratory of Agricultural Environment Pollution Integrated Control, Guangdong Institute of Eco-Environmental and Soil Sciences, Guangzhou 510650, China

Pot experiments were conducted to study the effects of ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) and citric acid (CA) on copper accumulation and translocation in Amaranthus retroflexus L., with exogenous copper concentrations of 0, 100, 200, 400 and 800 mg·kg-1. The concentrations of Cu with different speciations in both rhizosphere and bulk soil, and its enrichment characteristics in plant tissue were determined after adding 2.5 mmol·kg-1CA or EDTA to different copper treatment. Results showed that the ability of copper accumulation in different plant tissues followed the sequence of roots > leaves> stems when copper contents were less than 400 mg·kg-1, while roots > stems > leaves when copper contents were 400 mg·kg-1. BCFs and TFs of A. retroflexus were both less than 1, which indicated that A. retroflexus was not a copper hyperaccumulation plant under the present experiment condition. Both EDTA and CA can effectively improve enrichment ability of the plant for copper and enhance the transportation of copper from roots to shoots; EDTA was more effective, causing 3 512.71 mg·kg-1of shoots uptake under the 800 mg·kg-1copper content condition. The contents of total copper and exchangeable speciation inrhizosphere soil were increased for the EDTA amendment, while the content of Fe-Mn oxidizable speciation of copper decreased. The addition of CA promoted the chemical conversion of copper from Fe-Mn oxidizable speciation to carbonate speciation in rhizoshpere soil. It concluded that EDTA significantly improved the copper uptake of A. retroflexus and increased the content of total copper in rhizosphere soil, which resulted from the joint effects of the increasing migration activity of Cu-EDTA and the copper exclusion mechanisms of A. retroflexus.

copper; Amaranthus retroflexus L.; EDTA; citric acid; accumulation; translocation; phytoremediation

10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.08.022

X131.3；X173

1674-5906（2015）08-1399-07

刘婕，朱宇恩，刘娜，王翠红，吴山. EDTA和柠檬酸对反枝苋(Amaranthus retroflexus L.)Cu迁移富集影响研究[J].生态环境学报, 2015, 24(8): 1399-1405.

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2013山西省土壤环境与养分资源实验室开放基金（太原城郊土壤重金属迁移规律及健康风险评价研究2013002）；2012国家科技支撑计划煤化工污染场地修复关键技术与示范（2012BAC10B04-02）；2014山西省科技攻关重大专项工矿区先锋植物优化种植立体模式集成与示范（20121101009-0501）

刘婕（1989年生），女，硕士，研究方向为土壤污染修复与治理。E-mail: liujiesxdx10@163.com *通信作者：朱宇恩（1976年生），男，讲师，博士，研究方向为土壤污染修复与治理。E-mail: zhuyuen@sxu.edu.cn

2015-04-30