凝胶色谱－固相萃取－气相色谱－串联质谱法测定水产品中9种三嗪类除草剂

张华威，刘慧慧，田秀慧，邓旭修，黄 会，韩典峰，徐英江，宫向红

（1．山东省海洋资源与环境研究院，山东烟台 264006；2．烟台山水海产有限公司，山东烟台 264006；3．山东省海洋生态修复重点实验室，山东烟台 264006）

凝胶色谱－固相萃取－气相色谱－串联质谱法测定水产品中9种三嗪类除草剂

张华威1，2，刘慧慧1，3，田秀慧1，3，邓旭修1，2，黄 会1，2，韩典峰1，3，徐英江1，3，宫向红1，3

（1．山东省海洋资源与环境研究院，山东烟台 264006；2．烟台山水海产有限公司，山东烟台 264006；3．山东省海洋生态修复重点实验室，山东烟台 264006）

建立了水产品中9种三嗪类除草剂的凝胶色谱－固相萃取－气相色谱－串联质谱（GPC－SPE－GC－MS／MS）分析方法。样品采用乙酸乙酯提取，凝胶渗透过滤，石墨化碳串联氨基柱净化，选择离子监测模式测定，外标法定量。结果表明：扑灭津、阿特拉津、特丁津、西玛津、扑草净在1．0～50．0μg／L范围内线性良好，检出限均为1．0μg／kg，在1．0～10．0μg／kg添加水平，平均回收率为86．3％～119％，相对标准偏差为5．11％～10．1％；环草津、莠灭净、特丁净、西草净在2．0～100．0μg／L范围内线性良好，检出限均为2．0μg／kg，在2．0～20．0μg／kg添加水平，平均回收率为87．6％～112％，相对标准偏差为5．27％～9．56％。该方法稳定、可靠，适用于水产品中9种三嗪类除草剂的同时测定。

三嗪类除草剂；凝胶色谱（GPC）；固相萃取（SPE）；水产品；气相色谱－串联质谱（GC－MS／MS）

三嗪类除草剂是一类通过抑制植物光合作用而发挥作用的高效选择性除草剂，在世界范围内应用于农作物防除杂草的历史已有几十年。这类化合物结构特殊、化学性质较稳定、适用范围广、用量大，能够通过河流、沉降等方式进入环境，且长期存在于作物、环境水体和土壤中［1］。研究表明，环境水体中的阿特拉津会在鲫鱼体内产生富集效应［2］，并能抑制斑马鱼的生长繁殖［3］；水产养殖中用于清除有害藻类的扑草净，在海参中也会产生富集效应［4］。水产品中残留的三嗪类除草剂通过食物链进入人体后，会破坏人体的正常生理平衡，如阿特拉津会影响人体的内分泌系统，导致畸形、诱导有机体突变，是可能的致癌物质［5］，因此世界多国已将阿特拉津列入内分泌干扰剂化合物名单［6］。目前，三嗪类除草剂残留的检测主要集中在谷物［78］、蔬菜［9－10］和环境样品［11－17］中，而对于水产品中三嗪类除草剂残留的检测相对较少。随着生活水平的日益提高以及近年来食品安全事件频发，人们对食品安全的关注度也在不断提高，而我国尚未制定水产品中三嗪类除草剂的标准分析方法和残留限量，因此，建立水产品中三嗪类除草剂的残留检测方法非常必要。

目前，常用的三嗪类除草剂检测方法有气相色谱法（GC）［12］、气相色谱－串联质谱法（GCMS／MS）［13］、液相色谱法（HPLC）［1415］、液相色谱－串联质谱法（HPLC－MS／MS）［16］等，常用的样品净化方法有液－液萃取［18］、固相萃取［19－22］和凝胶渗透色谱法［23］。与单纯的色谱法相比，色谱－质谱联用法在定性及定量方面更加可靠；虽然HPLC－MS／MS具有较高的灵敏度，但其操作和维护成本高，对操作人员要求较高。

本研究拟采用凝胶渗透色谱与固相萃取法联用对样品进行前处理净化，气相色谱－串联质谱法对9种三嗪草类除草剂进行分离检测，以期达到更好的净化及分离检测目标化合物的目的。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

6890N／5973N气相色谱－质谱联用仪：美国Agilent公司产品；KQ－600E超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；Accuprep Mps凝胶色谱仪：美国J2Scientific公司产品；ASPEC XL4＋全自动固相萃取仪：法国Gilson公司产品；Laborota 4001旋转蒸发仪：德国Heidolph公司产品；N－EVAPTM112氮吹仪：美国Organomation Associates公司产品；Milli－Q Gradient超纯水仪：法国Millipore公司产品；TGL－10C高速离心机：上海安亭科学仪器厂产品。

乙酸乙酯、丙酮、正己烷（色谱纯）：美国Merck公司产品；环己烷（色谱纯）：美国Tedia公司产品；石墨化碳柱（500mg／6mL）：Bond Elut公司产品；氨基柱（500mg／3mL）：上海安谱科学仪器有限公司产品；实验用水均为去离子水。

扑灭津（propazine）、阿特拉津（atrazine）、特丁津（terbuthylazine）、西玛津（simazine）、环草津（cyprazine）、扑草净（prometryn）、莠灭净（ametryn）、特丁净（terbutryn）和西草净（simetryn）标准品（纯度均大于98．0％，其中莠灭净大于96．0％）：均为德国Dr．Ehrenstorfer公司产品，结构式示于图1。

图1 9种三嗪类除草剂结构式Fig．1 Structures of 9 triazine herbicides

1．2 样品的前处理

取5g样品于50mL塑料离心管中，加入25mL乙酸乙酯匀浆30s，超声提取20min，以4 000r／min离心10min，将上清液转移至150mL鸡心瓶中，再加入20mL乙酸乙酯，重复提取1次，合并上清液，于40℃下旋转蒸干后，使用环己烷乙酸乙酯溶液（1∶1，V／V）复溶，并定容至10mL；然后通过凝胶色谱仪净化，收集净化液，于40℃旋转蒸干，以2mL正己烷复溶；通过石墨化碳柱串联氨基柱净化，收集洗脱液，于氮吹仪上40℃吹至近干，用乙酸乙酯定容至0．5mL，上机测定。

1．3 仪器条件

1．3．1 凝胶色谱条件 凝胶渗透色谱柱：玻璃柱（300mm×25mm）；凝胶填料：Bio Beads（SX3），200～400目，25g；流动相：环己烷乙酸乙酯溶液（1∶1，V／V）；流速4．7mL／min；流出液收集时间7．5～15min。

1．3．2 色谱条件 色谱柱：DB－17MS（30m× 0．25mm×0．25μm）；载气：高纯氦气；柱流速1mL／min；进样口温度250℃；进样方式：无分流进样；进样量1μL；程序升温：初温50℃，保持1min，以20℃／min升至220℃，保持2min，再以2℃／min升至230℃，然后以30℃／min升至280℃，保持5min。

1．3．3 质谱条件 电子轰击（EI）离子源；接口温度280℃；四极杆温度150℃；离子源温度230℃；扫描方式：选择离子监测（SIM）模式。

2 结果与讨论

2．1 特征离子的选择

使用全扫描模式对9种三嗪类除草剂进行扫描，得到总离子流图，在保证仪器分辨率和灵敏度的条件下，选择相对丰度高的离子作为定量离子和特征离子。以扑草净为例，根据离子丰度选取其特征离子为m／z241、184、226，选择其中丰度最高的m／z241为定量离子，其质谱图示于图2。9种三嗪类除草剂的相对分子质量、定量离子、定性离子及其丰度比列于表1。

图2 扑草净的全扫描质谱图Fig．2 Ions chromatogram for prometryn in full scan mode

2．2 萃取溶剂的选择

根据相关文献，乙酸乙酯［13］、乙腈［7］、甲醇［9］和丙酮［8］均对三嗪类除草剂有很好的提取效果。分别采用上述4种溶剂对样品进行萃取实验，结果发现，4种溶剂的提取效率均能达到9 0％以上，采用乙腈或甲醇时会萃取出较多水

分，导致萃取液不易蒸干；采用丙酮时会萃取出较多色素和水分，导致萃取液不易净化，且不易蒸干；而采用乙酸乙酯时所萃取的水分和色素相对最少。因此，选用乙酸乙酯作为萃取溶剂。

表1 9种除草剂的相对分子质量、定量离子、定性离子及其丰度比Table 1 Relative molecular mass，quantitative ions，qualitative ions and abundance ratios of 9 triazine herbicides

2．3 凝胶色谱净化的选择

由于大部分水产品中含有脂肪等大分子物质，导致样品上机测定时出现较多杂峰，影响测定结果。因此，本实验在样品萃取完成后，将萃取液通过凝胶色谱仪进行过滤净化，去除脂肪等大分子杂质。

移取2mL乙酸乙酯与环己烷的混合标准溶液（1∶1，V／V）至样品瓶中，加入1mL玉米油，混匀，用乙酸乙酯环己烷溶液（1∶1，V／V）定容至10mL，按照1．3．1节条件进样，调节流速，使玉米油与9种三嗪类除草剂的分离度均不低于85％，采集254nm下的色谱图，根据标准物质出峰时间确定流出液的收集时间为7．5～15min。

实验表明，9种三嗪类除草剂的回收率均在98．2％～103％之间，符合实验测定要求。

2．4 固相萃取条件的选择

方法1：使用氨基柱对样品液进行净化。将氨基柱用3mL丙酮活化，再用5mL正己烷完全洗脱丙酮，加入样品液，并用5mL正己烷淋洗，然后使用10mL正己烷丙酮溶液（6∶4，V／V）洗脱，最后用10mL试管接收洗脱液。

方法2：使用石墨化碳柱串联氨基柱对样品液进行净化，实验方法同方法1。

实验表明：方法1和方法2中三嗪类除草剂的回收率相近，分别为83．5％～96．8％、81．6％～97．1％，但是方法1无法除去样品液中的色素，而方法2可以将大部分的色素去除。因此，采用石墨化碳柱串联氨基柱进行净化。

图3 9种三嗪类除草剂标准溶液选择离子扫描图Fig．3 Selected ions chromatogram of 9 triazine herbicides in SIM mode

2．5 线性关系

分别配制一系列标准工作溶液：准确称取0．010g 9种标准品，用甲醇溶解并定容至100mL，使其浓度为100mg／L，使用前用乙酸乙酯稀释至所需的质量浓度。其中扑灭津、阿特拉津、特丁津、西玛津、扑草净的标准系列浓度分别为1．0、5．0、10．0、20．0、50．0μg／L，环草津、莠灭净、特丁净、西草净的标准系列浓度分别为2．0、10．0、20．0、40．0、100．0μg／L。在优化的色谱和质谱条件下进行测定，标准溶液谱图示于图3。9种三嗪类除草剂药物的线性方程、线性范围和相关系数列于表2。上述9种化合物均呈现较好的线性关系，相关系数均大于0．99。

表2 9种三嗪类除草剂的线性方程、线性范围和相关系数Table 2 Linear equations，linearity range，correlation coefficient of 9 triazine herbicides

2．6 回收率、精密度和最低检出限

采用海参作为样品空白和基质添加，其空白谱图和加标谱图示于图4，回收率及变异系数情况列于表3。

2．7 实际样品结果分析

近年来，海参因其较高的保健作用受到人们的欢迎，本研究以海参为例，对取自某省的海参进行抽样检测。通过对22个海参样品进行测定，阿特拉津、扑草净、莠灭净的检出率较高；其中阿特拉津的检出率为64％，含量在0．90～3．62μg／kg之间；扑草净的检出率为23％，含量在1．52～21．3μg／kg之间；莠灭净的检出率为23％，含量在1．71～2．06μg／kg之间。对编号为1～10的海参样品测定的结果列于表4。某一海参样品谱图示于图5，此样品中阿特拉津含量为1．24μg／kg，扑草净含量为4．47μg／kg，莠灭净含量为2．06μg／kg，其他6种三嗪类除草剂均未检出。

图4 海参样品空白（a）和加标（b）谱图Fig．4 Chromatograms of sample blank（a）and spiked concentrations（b）of Stichopus japonicus

表3 海参中9种三嗪类除草剂类药物的回收率及变异系数Table 3 Recoveries and relative standard deviation of 9 triazine herbicides in Stichopus japonicus

表4 海参样品中三嗪类除草剂测定结果Table 4 Contents of triazine herbicides in 10 kinds of Stichopus japonicas

图5 海参样品的色谱图Fig．5 Chromatogram of Stichopus japonicus sample

3 结论

本研究建立了水产品中9种三嗪类除草剂的气相色谱－质谱联用分析方法。采用乙酸乙酯作为提取溶剂，凝胶色谱仪、石墨化碳柱串联氨基柱净化，选择合适的采集离子和升温程序，外标法定量。扑灭津、阿特拉津、特丁津、西玛津、扑草净的检出限均为1．0μg／kg，环草津、莠灭净、特丁净、西草净的检出限均为2．0μg／kg。该方法灵敏度较高、操作简单，适用于水产品中9种三嗪类除草剂的定量及确证分析。

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Determination of 9 Triazine Herbicides in Aquatic Products by GPC－SPE－GC－MS／MS

ZHANG Hua－wei1，2，LIU Hui－hui1，3，TIAN Xiu－hui1，3，DENG Xu－xiu1，2，HUANG Hui1，2，HAN Dian－feng1，3，XU Ying－jiang1，3，GONG Xiang－hong1，3
（1．Shandong Marine Resource and Environment Research Institute，Yantai 264006，China；2．Yantai Shanshui Seafood Co．Ltd，Yantai 264006，China；3．Shandong Province Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology，Yantai 264006，China）

A method for determination of 9triazine herbicides residues in aquatic products by gel permeation chromatography－solid phase extraction－gas chromatography tandem mass spectrometry（GPC－SPE－GC－MS／MS）was established．The sample was extracted with ethyl acetate，then cleaned up by gel permeation chromatography and purified by carbon and NH2solid phase extraction column．The analytes were determined

triazine herbicides；gel permeation chromatography（GPC）；solid phase extraction（SPE）；aquatic products；gas chromatography－tandem mass spectrometry（GC－MS／MS）

O657．63

A

1004－2997（2015）02－0177－08

10．7538／zpxb．youxian．2014．0054

2014－03－04；

2014－04－21

山东省科学技术发展计划项目（2012GHY11517）；山东省水生动物营养与饲料泰山学者岗位项目（2007－2012）；烟台市科技发展计划项目（2012134）资助

张华威（1989—），男（汉族），山东临沂人，助理工程师，从事食品质量与安全研究。E－mail：vipzhw＠126．com

宫向红（1968—），女（汉族），山东烟台人，研究员，从事食品质量与安全研究。E－mail：ggxxhh123＠163．com

时间：2014－08－20；

http：∥www．cnki．net／kcms／doi／10．7538／zpxb．youxian．2014．0054．html

in selected ion monitoring and quantified by external method．Propazine，atrazine，terbuthylazine，simazine and cyprazine show good linearity in the range of 1．0－50．0μg／L，and the detection limits of the five analytes are 1．0μg／kg．The average recoveries range from 86．3％to 119％when spiked at 1．0－10．0μg／kg with relative standard deviations from 5．11％ to 10．1％．Simetryn，prometryn，ametryn and terbutryn show good linearity in the range of 2．0－100．0μg／L，and the detection limits are 2．0μg／kg．The average recoveries range from 87．6％to 112％when spiked at 2．0－20．0μg／kg with relative standard deviations from 5．27％ to 9．56％．The method is stable and reasonable，and which can be used for the determination of 9triazine herbicides residues in aquatic products．